组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA阻断MAPK 信号通路并诱导HL?60细胞凋亡
作者：王颖 王生余 侯春梅 徐元基 杜芝燕 于晓妉
【摘要】 本研究旨在探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂－SAHA（suberoylanilide hydroxamic acid）诱导人急性髓性白血病细胞株HL?60凋亡的分子机制。采用MTT法，瑞氏?姬姆萨染色和Hoechst33342／PI荧光染色方法，检测SAHA对HL?60细胞生长的抑制作用及细胞的形态变化；通过流式细胞术、Western?blot方法测定HL?60细胞的周期变化以及多种信号蛋白的表达。结果表明：SAHA可以呈剂量时间依赖性抑制HL?60细胞的生长；经2 μmol/L SAHA处理12-48小时，HL?60细胞显示细胞周期被阻滞于G0/G1期；经Hoechst33342荧光染色后细胞核出现明显的凋亡小体结构；Western blot检测证实，SAHA作用HL?60细胞后caspase 3被激活，其底物蛋白聚ADP核糖聚合酶［poly(ADP?ribose) polymerase, PARP］发生剪切，细胞发生凋亡；对细胞凋亡相关信号转导通路P44/42 MAPK及PI3K/Akt检测结果表明，涉及MAPK信号通路的Raf及ERK激酶磷酸化受到明显抑制，而Akt及其下游mTOR激酶的活性没有明显改变。结论：SAHA对HL?60细胞的杀伤作用主要是通过诱导细胞凋亡实现，与细胞增殖相关的P44/42 MAPK信号通路被阻断是细胞凋亡发生的机制之一。
【关键词】 组蛋白去乙酰化酶抑制剂；SAHA； MAPK； 信号转导；细胞凋亡；HL?60细胞
Histone Deacetylase Inhibitor SAHA Induces Inactivation of MAPK Signaling and Apoptosis in HL?60 Cells
Abstract The study was aimed to investigate the molecular mechanisms of histone deacetylase inhibitor SAHA?induced apoptosis of acute myeloid leukemia cell line HL?60. The effect of SAHA on HL?60 cell proliferation was detected by MTT assay and the cell morphological changes were observed with Wright?Giemsa and Hoechst33342 staining. The cell cycle distribution was determined by flow cytometry and the expression of cell signaling proteins were detected by Western?blot analysis. The results showed that SAHA inhibited the proliferation of HL?60 cells in dose? and time?dependent manners，after 2 μmol/L SAHA exposure for 12-48 hours, the cell cycle was arrested at G0/G1 phase and apoptotic cell death was confirmed by either defined apoptotic bodies stained by Hoechst33342, Western blot showed cleaved?PARP, which represents the activation of caspase 3. The Western blot analysis indicated the activation of two important survival signal pathways after SAHA treatment, the phosphorylation of Raf and its downstream ERK kinases were remarkable downregulated, whereas the phosphorylation of AKT and its downstream molecular mTOR were not changed. It is concluded that SAHA?induced apoptosis of HL?60 cells is mediated by inactivation of p44/42 MAPK signaling pathway.
Key words HDAC inhibitor; SAHA; MAPK; signal transduction；apoptosis; HL?60 cell
SAHA（suberoylanilide hydroxamic acid）是继HMBA(hexamethylenebisacetamide)之后的第二代羟肟酸类的组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histon deacetylase inhibitor, HDACi）。与HMBA相比,它诱导鼠红白血病(murine erythroleukemia, MEL)细胞分化的活性是HMBA的2 000倍，并且在微摩尔(μmol/L)水平即可达到如此高的活性［1］。已知组蛋白的乙酰化状态可以影响基因的表达，当组蛋白处于乙酰化状态时，由组蛋白与DNA双链构成的核小体结构变得更为开放，有利于各种转录因子与DNA的结合，启动基因的表达。而当组蛋白处于低乙酰化状态时， 可出现转录抑制， 并介导肿瘤的发生，因此HDACi已经成为一类新型的抗肿瘤制剂。目前，SAHA已经在美国进入Ⅱ期临床试验。研究表明，SAHA可以选择性诱导细胞周期负调控子p21的表达，从而阻滞细胞周期［2］，同时可以诱导多种肿瘤细胞的分化和凋亡，但其诱导细胞凋亡的分子机制还不十分清楚。本研究采用HL?60细胞为研究模型，探讨SAHA诱导其凋亡的分子机制。
材料和方法
细胞系及培养条件
急性髓性白血病细胞HL?60为本室冻存保存株，用含10％灭活胎牛血清及青霉素、链霉素（各100 U／ml）、NaHCO3 (2 g/L)、HEPES (2.4 g/L) 的RPMI 1640 (Gibco BRL)培养液，置于37℃、5％ CO2的培养箱中培养。定期换液传代，取对数生长期细胞用于实验。
试剂
SAHA（suberoylanilide hydroxamic acid）由英国阿斯利康公司提供。MTT（methyl thiazolyl tetrazolium）购自Sigma公司,500 mg粉末溶于100 ml PBS中，过滤分装，-20℃避光保存。抗体acetyle?H3、PARP、p?Akt、Akt、p?mTOR、mTOR、p?Raf、p?Erk、Erk均购自Cell Signaling Technology公司。抗CDK4、Raf?1抗体购自Becton Dickinson PharMingen公司。抗p21抗体购自Santa?Cruz Biotechnology公司。抗β?actin抗体购自Oncogene公司。ECL试剂，BCA试剂盒购自PIERCE Biotechnology公司，Laemmli sample buffer 购自Bio?Rad公司。
细胞生长曲线测定
采用台盼蓝排斥实验。将对数生长期HL?60细胞以2×104／ml浓度接种于6孔板，设正常对照组及SAHA终浓度为1 μmol/L和2 μmol/L的处理组；于药物作用细胞后1-5天分别取细胞，用0.4%胎盘兰溶液混匀，3分钟内用血球计数板分别计数活细胞和死细胞数，并细胞存活率。
细胞存活率＝［活细胞数／（活细胞数＋死细胞数）］×100％
细胞存活率测定
采用MTT法，通过酶联仪测量细胞的OD值检测细胞对药物的敏感性。取对数生长期HL?60细胞以2×104／ml的密度接种于96孔板，每孔100 μl细胞悬液。SAHA处理浓度分别为0.5、1、2、3、5 μmol/L。每一个药物浓度设3个复孔，分别处理12、24和48小时。每个时相点结束后加0.5% MTT（每孔20 μl），4小时后加入细胞裂解液（每孔100 μl），置培养箱过夜。次日在酶联仪上调节到540 nm波长，以空白对照孔调零，读取各孔OD值。试验重复3次。按下列公式计算细胞生存率。
细胞存活率＝（加药组细胞OD平均值／
正常细胞OD平均值）×100％
细胞形态学观察
取对数生长期HL?60细胞，以2×104／ml的密度接种于培养瓶中，加SAHA（2 μmol/L）处理24和48小时。细胞经药物处理后，离心弃培养液，加入PBS混匀。吸取少量细胞悬液（5×104／ml）进行细胞甩片，甲醇固定10分钟后，进行瑞氏?姬姆萨染色，在显微镜下观察细胞的形态学变化。细胞经Hoechst33342染色，用荧光显微镜观察细胞是否出现凋亡小体。
细胞周期分析
取对数生长期细胞接种于6孔板，经SAHA（2 μmol/L）处理12、24、48小时后，1 500 ×g离心10分钟，收集细胞。用PBS洗沉淀，离心,收集于1.5 ml EP管中。然后以70％的冷乙醇（含1％FCS的PBS配制）固定过夜，-20℃冰箱保存。次日常温下1 500 ×g离心10分钟后，以PBS洗细胞沉淀。以含RNase A（终浓度200 μg/ml）的PBS 0.5 ml重悬细胞沉淀，37℃水浴30分钟。离心去掉RNA酶。向试管内加入PI染液(终浓度为100 μg/ml，贮存液为10 mg/ml)，室温下避光反应1小时后，上流式细胞仪检测。
蛋白表达的Western?blot检测
将SAHA（2 μmol/L）处理12、24、48小时的HL?60细胞10 000 ×g离心5分钟收集起来，加入Laemmli sample buffer（100 μl/1×106个细胞）裂解细胞。置热混匀仪上99℃加热8分钟，冰水浴冷却。然后4℃、10 000 ×g离心10分钟。转移上清至另一无菌EP管内，取适量样品应用BCA试剂盒测量蛋白浓度（具体步骤见试剂说明书）。配制SDS?聚丙烯酰胺凝胶，上样前加入5％β?巯基乙醇，每个样品上样50 μg蛋白。80 V电压电泳2小时，至溴酚蓝到达凝胶底部。转移蛋白至PVDF膜，80 V电压电泳2小时。将膜置5%脱脂牛奶室温封闭1-2小时，TBS+Tween洗膜3×5分钟。加入5%脱脂牛奶或5％BSA稀释的一抗封闭膜，置4℃摇床过夜。洗膜后再分别与相应的二抗（5%脱脂牛奶稀释）室温孵育1小时，洗膜3次。将等体积混合的ECL化学发光底物A、B液均匀加在PVDF膜上，显色5分钟，X光片曝光3分钟后，将X光片依次进行显影和定影。β?actin作为内参对照。
统计学分析
利用SAS 6.0软件对细胞生长抑制实验进行具有一个重复测量的二因素析因设计方差分析。
结 果
SAHA对HL?60细胞生长的抑制作用
与未经药物处理的正常对照组相比较，HL?60细胞经过不同浓度的SAHA处理后，细胞增殖受到明显抑制（图1）。药物敏感性实验显示，SAHA对细胞的杀伤作用具有时间和剂量依赖性(图2)。SAHA 2 μmol/L作用48小时后对细胞已经达到60％的杀伤效果，故在后续的实验中仅采用2 μmol/L的药物浓度。
SAHA阻断HL?60细胞周期并诱导细胞凋亡
流式细胞仪测定结果显示，SAHA作用细胞后12小时 细胞周期明显被阻滞于G0／G1期，表现为G0／G1期细胞比率由对照组的38%增加至85%, 伴有S期细胞数目明显降低。这一结果与SAHA对细胞增殖的抑制作用相一致。SAHA作用48小时，细胞出现sub?G1峰，提示HL?60细胞出现凋亡（图4）。Western blot结果显示，SAHA可明显上调细胞周期检测点的主要负调控因子P21的水平，同时降低CDK4的表达水平（图4），这些分子改变表明细胞周期在G1期的进程受到影响。聚ADP核糖聚合酶（PARP）是caspase 3的底物蛋白，在caspase 3活化的过程中会受到切割，被剪切后的PARP可以作为细胞凋亡的分子标志。图4显示，在SAHA作用48小时后出现PARP剪切后的条带，证实HL?60细胞内caspase 3被激活，细胞发生凋亡。
SAHA对HL?60细胞组蛋白H3乙酰化的影响
SAHA属于广谱型组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂，细胞经SAHA处理后，作为HDAC1和HDAC2底物的组蛋白H3的乙酰化明显增强，在药物作用12小时时最为明显，这说明SAHA对HDAC具有明显的抑制作用(图5)。
SAHA对HL?60细胞信号蛋白表达的影响
为探讨SAHA诱导HL?60细胞凋亡的分子机制，我们采用Western blot方法，对细胞内两条重要的细胞存活信号转导通路的活化状态进行了测定。结果表明，SAHA对细胞内Akt激酶及其下游的mTOR蛋白磷酸化没有影响，提示HL?60细胞经SAHA处理后，PI3K/AKT生存信号通路并没有受到影响。但细胞内另一条重要的信号通路Ras/Raf/Mek/Erk（p44/42 MAPK）被阻断，表现为Raf激酶及Erk激酶的磷酸化受到显著抑制 （图 6） 。 细胞内 p44/42
Figure 6. Effects of SAHA on various cell signal proteins of HL?60 cells. The levels of β?actin served as the loading control.MAPK信号通路在药物作用后24小时即出现活性降低，至用药后48小时，激酶活性出现明显降低，同期出现细胞凋亡，提示p44/42 MAPK信号通路阻断在介导细胞凋亡中起重要的作用。
讨 论
真核生物染色质的基本单位是核小体，由核心组蛋白（H2A，H2B，H3，H4），H1及DNA组成。核心组蛋白的乙酰化和去乙酰化是基因表达过程中的重要调控方式之一。组蛋白的高度乙酰化是转录活跃的一个标志，而低乙酰化与转录抑制有关。组蛋白的乙酰化多发生在组蛋白的N端碱性氨基酸中特定赖氨酸残基上。组蛋白乙酰转移酶（HAT）将乙酰辅酶A的乙酰基转移到赖氨酸的氨基端，中和组蛋白所带的正电荷，从而减弱DNA和组蛋白的相互作用，使转录因子易与DNA结合而促进转录。组蛋白去乙酰化酶(HDAC)则可以移去氨基端的乙酰基，增强DNA和组蛋白的相互作用，从而抑制转录。HAT和HDAC两者之间的动态平衡调节着组蛋白的乙酰化水平［3］。组蛋白乙酰化水平的异常在白血病细胞的，增殖和分化中起着很重要的作用［4］。
组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）是一类新型的抗肿瘤药物。通过抑制HDAC的活性，诱导靶细胞中组蛋白高度乙酰化，由于乙酰化修饰可以改变组蛋白与DNA链间的结合状态，使染色质结构变得疏松，有利于转录因子与DNA链的结合，启动某些特异性基因的表达，从而达到阻断肿瘤细胞的生长［5］。实验表明，HDACi可以在体外有效抑制肿瘤细胞的增殖，在体内可以抑制实体瘤的生长，并能有效抑制肿瘤血管的形成。更为重要的是，它能特异性杀伤肿瘤细胞，并对正常细胞影响较小［6，7］。
本研究采用SAHA处理人HL?60白血病细胞。结果表明，SAHA可抑制细胞的生长，阻断细胞周期于G0/G1期，并诱导细胞凋亡。SAHA对细胞周期的调节表现在它可以增强CDK抑制因子P21蛋白的表达。本实验中观察到SAHA作用12小时后P21蛋白的表达即明显增强。增强的P21蛋白表达可以通过抑制cdc2和CDK从而阻断细胞周期在G1期［8］。本实验中也检测到SAHA在增强P21蛋白表达的同时降低CDK4的水平使细胞发生G0/G1期阻滞。近年来，有试验表明P21蛋白同样在细胞的分化和凋亡中发挥作用。如：经细胞分化诱导剂phorbol或bryostatin?1处理白血病细胞，或者加入组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理，再加入CDK的抑制剂flavopiridol后，发现flavopiridol会促进细胞发生凋亡［9，11］。HDACi诱导P21的表达增强，表明CDK抑制因子在HDACi介导的细胞凋亡中同样发挥着重要的作用。
细胞外信号调控细胞生长是通过激活细胞内不同的信号传导途径实现的。PI3K/AKT生存信号通路具有抗凋亡作用，此信号通路的调节紊乱会导致细胞的恶性转化。在本实验中AKT及其下游信号分子mTOR的表达均没有明显改变，表明SAHA处理细胞后并没有影响到此信号通路。MAPK通路是典型的细胞生长调控信号途径，目前发现细胞内有3种家族成员：JNK，P38，ERK1/2。其中Ras/Raf/MEK/ERK通路与肿瘤细胞增殖的关系最为密切，此信号通路被激活后，ERK1/2被磷酸化，转位至细胞核，作用于转录因子（如NF?Κb, c?myc等），调控基因的表达，产生不同的生物学效应［12，13］。经SAHA处理细胞后，Raf?1和Erk蛋白的磷酸化呈时间依赖性降低，提示SAHA对HL?60细胞凋亡的诱导是通过阻断Ras/Raf/MEK/ERK（P44/42 MAPK）信号通路而实现的，而与PI3K/AKT通路并无关联。
近年来有研究表明，HDACi不仅可以使组蛋白发生乙酰化，而且还能够诱导细胞内的非组蛋白发生乙酰化修饰［14］。2002年, Yu等［15］首次发现HDACi可以乙酰化修饰胞内的热休克蛋白90(HSP90)，从而影响其分子伴侣的功能，导致其多种靶蛋白通过泛素?蛋白酶体途径降解，进而介导细胞凋亡。最新的研究表明，慢性髓性白血病细胞K562经HDACi（LAQ824,LBH589）处理后，细胞内HSP90发生明显的乙酰化修饰，从而影响了其与靶蛋白BCR/ABL的结合，并介导信号通路中Raf?1和Akt的表达下调，进而诱导细胞凋亡［16］。在本实验中，HSP90的底物蛋白Raf?1及CDK4蛋白表达降低，提示SAHA可能对HSP90的分子伴侣功能有抑制作用，但同为HSP90底物蛋白的AKT表达水平却并未受影响，因此SAHA是否通过抑制HSP90分子伴侣功能而介导HL?60细胞凋亡尚需要更多的实验证实。
【】
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