重组人血管内皮生长因子D诱导鸡胚尿囊膜血管增生
作者：陈浩 丁秀云 高媛 柳晓兰 高建恩 孙启鸿
【摘要】 为了表达和纯化具有生物学活性的人血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)?D，探讨VEGF?D对血管增生作用，从人胎肺组织中提取总RNA，设计特异性引物并应用RT?PCR法扩增VEGF?D成熟肽片段；经测序证明目的片段序列正确后，构建重组表达质粒pGEX?5X?1/VEGF?D并在大肠杆菌BL21（DE3）中进行GST?VEGF?D融合蛋白的表达。结果表明，融合蛋白的分子量约为38 kD，表达量占菌体总蛋白的15%以上，抗GST和抗VEGF?D的抗体均能识别融合蛋白；纯化的GST?VEGF?D融合蛋白与VEGFR?3/Fc具有结合活性，并能刺激红白血病细胞系HEL细胞生长；在鸡胚尿囊膜实验中GST?VEGF?D具有促进鸡胚尿囊膜血管生成的作用。结论：成功表达了具有生物学活性的重组人VEGF?D融合蛋白，为进一步研究VEGF?D的作用机理提供了实验模型。
【关键词】 血管内皮生长因子D；血管内皮生长因子受体3；鸡胚尿囊膜；血管生成
Recombinant Human VEGF?D Induces the Angiogenesis of the Chick Embryo Chorioallantoic Membrane
Abstract Vascular endothelial growth factor?D (VEGF?D) and vascular endothelial growth factor receptor?2,?3 (VEGFR?2,?3) with their corresponding signaling pathway play significant roles in the development of the embryonic vascular system and pathological lymphangiogenesis. The study was aimed to express and purify the GST?VEGF?D fusion protein, and to explore the angiogenesis effect of VEGF?D. The total RNA was extracted from human fetal lung tissue, and the mature form of VEGF?D was expanded by polymerase chain reaction (PCR), then the plasmid pGEX?5X?1/VEGF?D was reconstructed and the GST?VEGF?D fusion protein expressed in transformed E.coli BL21?DE3.The results showed that the molecular mass of this fusion protein was 38 kD and compassed more than 15% of the total bacteria proteins.The fusion protein was recognized by anti?GST and anti?VEGF?D antibodies.The soluble GST?VEGF?D fusion protein could interact with VEGFR?3/Fc and was able to stimulate the proliferation of human erythroleukemia cell line（HEL） cells. The data of chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) experiments indicated that GST?VEGF?D could induce the CAM angiogenesis. It is concluded that the GST?VEGF?D fusion protein with biological activity was successfully expressed, and which may provide an experimental model for the investigation of the VEGF?D?induced angiogenesis and lymphangiogenesis.
Key words VEGF?D;VEGFR?3; angiogenesis; chick embnyo chorioallantoic menbreme
肿瘤转移通常是人类癌症致死的主要原因之一。目前认为，肿瘤转移的通路主要有以下三种方式：第一，肿瘤细胞浸润血管，直接进入血道形成转移灶；第二，通过侵入已存在的淋巴管进入淋巴循环系统，进而通过淋巴?血循环转移到新的组织中形成转移灶；第三，肿瘤细胞从实体瘤上脱落，直接种植到周边组织形成转移。在这些过程中，肿瘤细胞分泌各种生长因子，刺激肿瘤生成新生血管和淋巴管（lymphangiogenesis），进而促进恶性肿瘤淋巴转移，其中血管内皮生长因子家族(vascular endothelial growth factor family， VEGF)及其受体血管内皮生长因子受体 (vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)信号系统在肿瘤血管发生和淋巴管发生过程中发挥了重要作用。 目前已经发现 5 种VEGF：VEGF?A、B、C、D和胎盘生长因子（placenta growth factor，PIGF)。这些VEGF能选择性地与膜上的3种受体［VEGFR?1(Flt1)、VEGFR?2(KDR) 和 VEGFR?3(Flt4)］中的1种或2种作用，促进血管增生和（或）介导淋巴管的增生［1］。 VEGF?A和VEGF?B能与VEGFR?1、VEGFR?2结合，刺激血管内皮增生并增加血管通透性，在血管新生（vasculogenesis）和血管增生（angiogenesis）过程中起重要作用［2］。VEGF?C和VEGF?D是近年发现的与淋巴增生相关的因子，VEGF?C与VEGFR?2和VEGFR?3作用促进肿瘤淋巴管发生和转移［3,4］。VEGF?D与VEGFR?3和VEGFR?2结合，不仅促进淋巴管的生成而且促进血管生成和发生［4,5］。
VEGF?D以前体的形式合成，在结构上与VEGF?C高度同源，经过翻译后加工去掉N?端和C?端多肽，成为含有VEGF同源区（VEGF homology domain, VHD）糖蛋白的成熟形式，提高了与VEGFR?2，VEGFR?3的结合能力［6］。本研究从人胎肺组织中克隆VEGF?D基因的VHD片段，在大肠杆菌中进行表达，生物学活性检测结果表明重组GST?VEGF?D不仅具有与VEGFR?3/Fc结合的活性，还具有刺激红白血病细胞系HEL细胞生长和促进鸡胚尿囊膜（CAM）血管生成的作用。
材料和方法
主要试剂
pGEX?5x?1表达载体和抗GST单克隆抗体均为Amersham公司产品；大肠杆菌BL21（DE3）菌株购自Novagen公司；GST预装柱及相关的纯化设备为Amersham公司产品；PCR产物纯化试剂盒、质粒提取试剂盒和pGEM?T连接试剂盒均购自Promega公司； 各种限制性内切酶购自Takara公司；抗VEGF?D单克隆抗体购自R&D system公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG为中杉金桥公司产品；HEL细胞购自医学院细胞库；MTT为Sigma公司产品；其余试剂均为国产分析纯。
VEGF?D目的片段（VHD）的获得和重组表达质粒的构建
根据VEGF?D的VHD片段的编码序列，设计合成PCR反应引物：正向：5′CCGGAATTCTTTGCGGCA ACTTTCTATGACATTG 3′；反向：5′ ATAAGAA TGCGGCCGCTCTTCTGATAATTGAGTATGGATGG 3′。从人胎肺组织中提取总RNA，用Invitrogen公司的Transcript反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，利用PCR反应从cDNA扩增目的片段。反应条件：94℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 1分钟，进行30个循环。PCR产物纯化后连入T载体。测序正确后，分别对载体pGEX?5X?1和连有目的片段的T载体进行NotⅠ和EcoR Ⅰ双酶切，构建重组表达质粒pGEX?5X?1/VEGF?D，应用菌落PCR和酶切鉴定重组质粒。
GST?VEGF?D融合蛋白在大肠杆菌中的表达
将pGEX?5X?1/VEGF?D重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株，挑取含pGEX?5X?1/VEGF?D质粒的单菌落接种于含氨苄的LB培养基中，37℃培养过夜。按1%接种量转接到含氨苄的新鲜2YT培养基中，继续培养至OD600约为0.5-0.8,加入IPTG至终浓度0.2 mmol/L，30℃继续培养3小时后收集菌体。10% SDS?PAGE分析融合蛋白表达情况。
收获的菌体重悬于pH 7.3的PBS中，于冰浴中超声破碎细胞，向超声破碎后的溶液中加入20% Triton X?100至终浓度1%，冰浴30分钟，10 000×g离心收集上清和沉淀。10% SDS PAGE 进行检测。
重组GST?VEGF?D融合蛋白的纯化
按GST预装柱说明书步骤进行。简述如下：用两倍柱体积的结合缓冲液平衡后，取5 ml过滤后的样品上样；流速约为0.2 ml/min，用5倍结合缓冲液洗涤；洗脱液洗脱，流速为1 ml/min。洗脱组分用SDS?PAGE进行分析鉴定。合并目的蛋白组分，双蒸水透析，透析后的样品用冷冻干燥机干燥，-20℃保存。
Western blot鉴定
融合蛋白分别用抗GST抗体(1∶1 000)和抗VEGF?D单然隆抗体(1∶1 000)进行检测，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG（1∶5 000），用偶联辣根过氧化物酶的羊抗鼠抗血清（中杉金桥公司）和ECL试剂（Amersham）使结合的抗体显色。
VEGFR?3/Fc 与GST?VEGF?D的结合反应
分别以VEGFR?3/Fc(0.5 μg/ml)和GST?VEGF?D(4 μg/ml)包被ELISA板，4℃过夜,PBS洗后用含10 %小牛血清的PBS封闭。分别加入GST?VEGF?D和VEGFR?3/Fc孵育1小时, 用PBS+Tween 20洗3遍后加入抗VEGF?D和VEGFR?3/Fc的单克隆抗体, 孵育1小时, 用PBS+Tween 20洗涤, 加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG二抗, BCIP/NBT显色液显色,OD405nm检测。
MTT实验
HEL细胞按照1×105 /ml的浓度接种于96孔板,100 μl/well，分别加入不同浓度的GST、GST?VEGF?D, 100 μl/well(每个浓度3个平行孔), 在37℃、5% CO2孵箱培养72小时后，每孔加MTT溶液20 μl，37℃孵育4小时后加入二甲基亚砜溶解沉淀，测OD492 nm值，用SAS 8.0作两因素的析因设计的方差分析。
鸡胚尿囊膜实验
将购自中国农业科学院畜牧研究所的受精卵鸡蛋于39℃孵育3天，无菌条件下加入不同剂量（5、10、20 μg/ml）的可溶性的GST?VEGF?D蛋白，以GST为对照，用盖玻片盖住，石蜡封口，继续在38℃孵化3天后打开，拍照。用CMIAS?Ⅱ图像分析软件进行血管计数并血管面密度NA（V）。用SAS 8.0作单因素多水平方差分析。
统计学处理
采用SAS 8.0统计软件分析处理。
结 果
VEGF?D片段的扩增
从人胎肺组织中提取总RNA，经RT?PCR反转为cDNA。通过PCR法扩增目的片段后经1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定，条带介于250和500之间，与理论推测值351 bp相符（见图1）。
Figure 1. Electrophoresis pattern of RT?PCR of VEGF?D mature fragment on agarose gel. Lane 1: DNA marker. Lane 2: VEGF?D PCR product.重组质粒的构建与鉴定
PCR产物经纯化后直接连接到pGEM?T载体上，构建pGEM?T/VEGF?D重组质粒，基因测序正确后用NotⅠ和EcoR Ⅰ双酶切连接到pGEX?5X?1上构建重组表达质粒pGEX?5X?1/VEGF?D。 利用EcoR Ⅰ和NotⅠ进行重组质粒的双酶切鉴定（如图2）。重组质粒插入片段大小约为351 bp，证明pGEX?5X?1/VEGF?D构建正确。
融合蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化
GST和VEGF?D的VHD片段的蛋白分子量分别为26 kD和12 kD，GST?VEGF?D的分子量理论值应为38 kD。SDS?PAGE分析含pGEX?5X?1/VEGF?D的大肠杆菌BL21（DE3）的蛋白表明，融合蛋白分子量与预期结果一致，为38 kD左右。表达产物主要以包涵体的形式存在（图3）。
Figure 3. Expression and identification of GST?VEGF?D fusion by SDS PAGE.Lane 1: protein mole?cular weight standard. Lane 2: E.coli BL21 control. Lane 3: GST control. Lane 4: supernatant of GST?VEGF?D. Lane 5: precipitation of GST?VEGF?D. 以牛血清白蛋白为标准蛋白，将电泳后凝胶中经考马斯亮蓝染色得到的蛋白带用GelPro软件分析，GST?VEGF?D融合蛋白占细菌总蛋白的15 %。
对超声后的细菌蛋白用含1% Triton X?100的PBS溶解之后，经GST?亲合层析柱纯化，然后收集洗脱组分，再经透析除去谷胱甘肽。SDS?PAGE检测蛋白的纯度，结果如图4所示。可见在纯化的组分中含有部分融合蛋白降解后形成的GST。
Figure 4. Identification of purified GST?VEGF?D by SDS PAGE.Lane 1: protein molecular weight stan?dard. Lane 2. GST control. Lane 3: supernatant of GST?VEGF?D. Lane 4: purified recombinant protein of GST?VEGF?D.
融合蛋白的Western blot分析
分别用抗GST抗体和抗VEGF?D单克隆抗体为一抗对融合蛋白进行 Western blot分析，结果在38 kD都呈现特异性的条带（图5）。
Figure 5. Analysis of recombinant GST?VEGF?D by Westen blot.Lane 1 and 3: GST control. Lane 2 and 4: GST?VEGF?D fusion protein.
GST?VEGF?D与VEGFR?3/Fc的结合活性分析
将浓度为1、2 μg/ml的VEGFR?3/Fc与20 μg/ml的GST?VEGF?D混合，以VEGFR?3/Fc纯品为对照，通过检测450 nm处的OD值分析GST?VEGF?D与VEGFR?3/Fc的结合活性，结果如图6所示，表明重组人GST?VEGF?D可与VEGFR?3/Fc相互作用。
Figure 6. In vitro characterization of GST?VEGF?D and VEGFR?3/Fc. GST?VEGF?D fusion protein is able to interact with VEGFR?3/Fc. Results are shown as the ±SD of three wells.
GST?VEGF?D促进HEL细胞增殖
以GST为对照，检测GST?VEGF?D对HEL细胞生长的影响，结果如图7所示。结果表明，与GST对照组相比，GST?VEGF?D融合蛋白可显著刺激HEL细胞的增殖（F=17.01，P<0.0003）,随着GST?VEGF?D浓度的升高，HEL细胞量也随之增加(F=6.59,P<0.0002)，而随着GST浓度的升高，HEL细胞数量并没有明显变化(F=1.07,P>0.05)。这些结果说明GST?VEGF?D融合蛋白在一定浓度范围内可以刺激HEL细胞的生长。
Figure 7. Stimulation of HEL cells proliferation with GST?VEGF?D.Results are shown as the ±SD of three wells. *P<0.01, compared wtih GST.
GST?VEGF?D对鸡胚尿囊膜血管的影响
鸡胚尿囊膜血管生成模型已经被广泛地应用在促进血管生成和抗血管生成分子的研究中。在我们的实验中，随着GST?VEGF?D剂量的升高，鸡胚尿囊膜毛细血管的数量也随着增加(F=3.34,P<0.0425)，当GST?VEGF?D达到20 μg时，尿囊膜血管可形成立体的致密的网状结构，而对照组没有明显的变化（图8）。
2.讨 论
VEGF?D基因编码53 kD的前体形式的VEGF?D，经过细胞内或细胞外蛋白酶的加工，去掉N?末端和C?末端的多肽成为只含VEGF同源区（VHD）片段的成熟形式的VEGF?D。与未经加工的VEGF?D相比，经过加工的VEGF?D结合VEGFR?2和VEGFR?3的能力分别提高了290倍和40倍，因此具有最高的结合活性［6］。本研究从人胎肺中直接克隆VEGF?D的VHD片段，构建重组表达载体并在大肠杆菌中成功表达融合蛋白GST?VEGF?D。ELISA和MTT实验表明，融合蛋白GST?VEGF?D能与重组人VEGFR?3结合，刺激HEL细胞生长，说明本实验所表达的成熟形式的VEGF?D蛋白具有生物学活性，与报道相一致［7］。报道中成熟的VEGF?D的分子量为21 kD的非共价结合的二聚体，而本实验中目的蛋白的分子量为12 kD的单体也具有相应的活性。
鸡胚尿囊膜是鸡胚外的一层膜，主要功能是提供进行气体交换的表面，同时鸡胚尿囊膜功能的行使也依赖于致密的血管网的支撑。正是由于鸡胚发育过程中大量尿囊膜血管的形成，为研究血管发生和形成提供了很好的模型［7］。
VEGF?D与VEGFR?3结合促进胚胎期淋巴管增生和形成，而且在肿瘤淋巴转移过程中发挥了重要作用。VEGF?D还可以与VEGFR?2作用，刺激血管的形成。在本实验中，成熟形式的VEGF?D能够促进尿囊膜血管的形成，使之形成毛细血管网，这里VEGF?D与VEGFR?2的结合可能发挥了主要作用。因为未经过加工的VEGF?D前肽只与VEGFR?3结合，而成熟形式的VEGF?D与VEGFR?2和VEGFR?3的结合能力都升高，但与VEGFR?2的亲和能力的提高是与VEGFR?3能力提高的７倍，而VEGFR?2主要介导血管的形成［6］，因此有理由认为鸡胚尿囊膜血管的大量形成归功VEGF?D与VEGFR?2的结合而介导的信号通路。
总之，本研究利用大肠杆菌系统成功表达重组GST?VEGF?D融合蛋白，GST?VEGF?D不仅具有与VEGFR?3/Fc结合的活性，还能刺激HEL细胞生长，并促进鸡胚尿囊膜血管生成，为进一步探讨VEGF?D的作用机理，阐明VEGF?D/VEGFR?3信号通路的作用奠定了基础。
【】
1Staker SA, Achen MG, Jusila L, et al. Lymphangiogenesis and cancer metastasis. Nature Reviews Cancer, 2002; 2: 573-583
2Risau W. Mechanisms of angiogenesis. Nature, 1997; 386: 671-674
3Skobe M, Hawighorst T, Jackson DG, et al. Induction of tumor lymphangiogenesis by VEGF?C promotes breast cancer metastasis. Nat Med, 2001; 7: 192-197
4 Stacker SA, Caesar C, Baldwin ME, et al. VEGF?D promotes the metastatic spread of tumor cells via the lymphatics. Nat Med, 2001; 7(2): 186-190
5Yulong H, Karpanen T, Alitalo K. Role of lyphangiogenic factors in tumor metastasis. Biochimica et Biophysica Acta, 2004; 1654: 3-12
6Stacker SA, Stenvers K, Caesar C, et al. Biosynthesis of vascular endothelial growth factor?D involves proteolytic processing which generates non?covalent homodimers. J Biol Chem, 1999; 274: 32127-32136
7Scavelli C, Weber E, Agliano M, et al. Lymphatics at the crossroads of angiogenesis and lymphangiogenesis. J Anat 2004; 204: 433-449
