Ang?2与VEGF的协同作用及其在抗肿瘤血管新生治疗中的应用
作者：何立丽 张伟京 苏航 徐东刚
【摘要】 肿瘤的血管生成是个复杂的过程，其中血管生成素（Ang）家族和血管内皮细胞生长因子（VEGF）家族协同作用至关重要。Ang家族是唯一含受体激动剂及抑制剂的促血管生成因子，均能与内皮细胞上的酪氨酸激酶受体Tie?2结合，参与血管生成。肿瘤细胞分泌VEGF，后者协同Ang?2促进血管的生成。对VEGF及Ang结构与作用机制的深入研究将有助于新的具有临床应用价值的抗血管生成药物的研制。本文就Ang及其受体的结构和作用机制，Ang及其受体在肿瘤血管新生中的应用，以及Ang?2与VEGF的协同作用机制问题作一综述。
【关键词】 血管生成素；血管内皮细胞生长因子；血管生成
Synergism between Ang?2 and VEGF and Its Application of Anti?angiogenesis in Tumor Therapy ——Review
Abstract Tumor angiogenesis is a complicated process in which VEGF and the members of Ang family have been proposed to play an important role. Ang family is the only vascular growth factor family including activators and inhibitors. They can all bind with specific tyrosine kinase receptor Tie?2 and participate in angiogenesis. Vascular endothelial growth factor (VEGF) is secreted by tumor cells and coordinates with Ang to promote angiogenesis. Further research on the structure and functional mechanism of VEGF and Ang will contribute to develop a new type of antiangiogenesis medicine, which might have good perspect in clinical practice. In this paper, the structure and action mechanism of Ang family and its receptor Tie?2, the application of Ang family and Tie in tumor therapy, and the synergic mechanism between Ang and VEGF were summarized.
Key words angiopoietin ;vascular endothelial growth factor; angiogenesis
原发肿瘤的生长和转移依赖于肿瘤血管生成(angiogenesis)。血管生成是指新生血管在原有血管床的基础上形成的过程,是一系列血管生长因子和血管生长抑制因子协同作用的结果。血管生成素(angiopoietin，Ang)家族与血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及其它促血管生成因子相互作用，共同促进肿瘤性血管生成。肿瘤的血管系统已成为一个崭新的、有希望的抗肿瘤治疗靶点。本文就VEGF及Ang结构与作用机制、生物学作用及在抗肿瘤血管新生治疗方面的研究进展作一综述。
Ang及其受体的结构及作用机制
Ang及其受体是近年来发现的血管生成调节因子。随着对Ang作用机制的深入研究，对其在血管生成中的作用以及与肿瘤的关系有了进一步的认识。
Ang家族包括4种血管生成因子:血管生成因子?1（Ang?1）、血管生成因子?2（Ang?2）、血管生成因子?3（Ang?3）、血管生成因子?4（Ang?4），它们均属于酪氨酸激酶受体Tie?2（tyrosine kinase with immunoglobin and epidermal growth factor homology domain 2,Tie?2）的配基。Ang?1的基因位于8q22-q23，cDNA编码498个氨基酸［1］。 Ang?1主要由血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）和血管周围细胞分泌，并在在胚胎期血管间质和成人的肺、冠状动脉、皮肤、肌肉、子宫内膜、卵巢、前列腺等组织中表达［2］。Ang?1激活其受体Tie?2，对血管的生成、血管内皮细胞（vascular endothelial cell，VEC）的稳定和血管的重塑起调节作用。
Ang?2基因位于8p23， 其 cDNA编码 496 个氨基酸。Ang?2的氨基酸序列60％与Ang?1一致。Ang?2主要由VEC分泌,并在胎儿肝血管、成人卵巢、胎盘和子宫等组织中表达。血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维生长因子（bFGF）和缺氧可增加Ang?2的表达；而Ang?1和转化生长因子?β1(TGFβ1)可抑制Ang?2的表达。Ang?2与Ang?1具有高度同源性，与Tie?2有高度亲和力。但通过对细胞的检测，Ang?2对其受体既可以起到激活作用，也可以起到拮抗作用。Ang?2在使脉管系统失去稳定性方面起到关键作用，George等［3］观察到小鼠的Ang?2敲除后血管系统受到丧失稳定性的信号影响，处于更为脆弱及可塑的状态，从而使随后的血管重建成为可能。此外，Ang?2基因敲除的小鼠还表现出其他缺陷，这些表明Ang?2在某些情况下也有促进作用。如Ang?2在大动脉壁上高表达，敲除Ang?2的小鼠可表现为动脉壁发育不良，同时淋巴管的发育也受到影响。
Ang?2与VEGF的协同作用及其在抗肿瘤血管新生治疗中的应用Ang?2在肿瘤血管新生中作用显著。在多种癌组织均见到有Ang?2及其受体表达增加，特别是在肿瘤边缘的新生血管区。目前研究认为，Ang?1的表达与肿瘤血管形成的多少关系不大;而Ang?2表达是肿瘤血管新生起始及加强的因素，与肿瘤血管形成数目、临床分期、预后关系密切［4］。
Tie?2 是内皮细胞特有的激酶受体，仅存在于血管内皮细胞表面，在肿瘤血管发生方面有着重要的作用。Tie?2主要的配基为Ang?1和Ang?2。采用同源性克隆方法鉴定了Tie?2的新型配基，Ang?3 （鼠源）Ang?4（人源），两者结构与Ang?1 、Ang?2相差较大，但它们均可与Tie?2受体结合。Lee等［5］通过原代培养小鼠内皮细胞发现，Ang?3与Ang?4可形成二硫键连接的二聚体。Ang?3在小鼠内皮细胞中可作为Tie?2的激活剂发挥作用，而在体内外试验中，Ang?3 对于人类Tie?2受体不能起到激活的作用。Ang?4在人类内皮细胞中起到Tie?2的激活剂作用，可以促使内皮细胞存活和迁移，而对于鼠源Tie?2受体仅起到中等程度的激活作用。但通过将重组蛋白Ang?3和重组蛋白Ang?4植入小鼠角膜后第8天,发现两者均有使血管增生的潜力，且Ang?3作用略强于Ang?4。
Ang?2的作用原理仍不是很明确。Fiedle等［6］使用三维内皮细胞和平滑肌细胞共培养技术研究Ang?1和Ang?2的效应子作用。在此模型中，内皮单层细胞的完整性是受Tie?2信号调控的。Ang?2对内皮组织的快速自分泌调节是通过内部自分泌环机制实现的。Ang?2不仅分布于内皮细胞，还储存于韦-帕体内(Weibel?Palade body),它们受到激活后几分钟内即可释放Ang?2。由此看来，Ang?2主要是控制快速血管反应。当今最引人瞩目的发现在于观察到Ang?2能够快速地干扰内皮单层细胞的完整性。内皮单层细胞瓦解的最初征象，可在30分钟内观察到;而大量的内皮细胞解离象则在4小时后才可看到。Ang?2 在成人中主要起到维持血管内皮完整的作用，控制快速的血管反应。
Ang及其受体在肿瘤血管新生治疗中的应用正常血管的发育需要Tie受体的正确调节，这是通过调整血管重构及内皮细胞与周边支持细胞及平滑肌细胞的相互作用实现的。Ang?1可结合并诱导Tie?2的酪氨酸磷酸化，但并不直接刺激体外培养的内皮细胞的增长，然而它与血管发育紧密联系，在内皮细胞的发育过程中起到重要的作用。Ang?2可结合内皮细胞膜上Tie?2受体，同时抑制 Ang?1的功能。细胞内抗体的应用可替代靶向定位于DNA或mRNA使基因失活的治疗方法。优点为在翻译水平之后作用，细胞内抗体可直接指向相关的亚细胞层和目的蛋白精确靶位，封闭表达蛋白的诸多功能之一。基因治疗的策略在于用复制缺陷的重组腺病毒传递特异的带有Tie?2的胞内抗体，如pAd?2S03可使实体肿瘤的体积缩小63％-75％。值得注意的是，在胞内抗体引起Tie?2下调的治疗中并未出现不良副作用，这表明此治疗方案是安全有效的［7］。
Mochizukil等［8］最新研究表明，在成熟组织和培养的内皮细胞中Ang?2有促进血管生成的作用。通过鼠脑毛细血管细胞系探讨Ang介导的下游信号途径的研究表明:Ang对血管的增殖无影响，但有受激趋向性和管状结构形成的特性。Ang?2激活cFes和cFyn,导致管状结构的形成。cFes、cFyn和cSrc是Tie?2的下游分子，调节Ang?2介导的分子反应。PI3激酶也是Tie?2的下游信号分子之一。Ang?2可能通过cFes激活PI3激酶，反过来调节含有磷酸酪氨酸的蛋白与PI3激酶在血管内皮细胞上结合。cSrc可被Ang?2激活。Src激酶家族的另一成员cFyn也参与Ang?2调节的血管管状结构形成。Src家族激酶抑制剂PP2可以减弱Ang?2 诱导的血管管状结构的形成。识别内皮细胞特有的信号分子下游区cFyn和它的抑制作用有助于抗血管新生的。
Stoeltzing等［9］应用重组Ang?1转染人结肠癌细胞HT29以评价Ang?1对肿瘤生长和血管形成的影响。研究发现，转染Ang?1的HT29移植瘤比转染空载体的移植瘤的肿瘤体积小，血管计数低，肿瘤细胞增殖程度低，血管周围细胞包绕程度高，以及血管渗透性低。研究结果提示，对于转移性结肠癌的病人，Ang?1可能起到抗肿瘤性药物或抗血管渗透性药物的作用。
Ang?2与VEGF的协同作用机制的研究人类VEGF 基因定位于6号染色体短臂（6p21.3 ）上，全长14 kD，由8个外显子和7个内含子组成。VEGF是由两条亚基及亚基内二硫键交联形成的高度保守的糖蛋白二聚体， 是一种碱性蛋白， 分子量为46 kD，PI=8.5; VEGF对热、酸稳定，但60℃或pH<3.5时不稳定，可被还原剂如β?巯基乙醇或二硫苏糖醇完全灭活。
Brock等［10］报道，VEGF是已知的最强的血管渗透剂，高于组胺50 000倍。
此外，VEGF可促进肿瘤的转移。肿瘤的增殖和转移依赖血管生成，早期阶段，肿瘤直径小于1 mm以前，肿瘤生长缓慢，肿瘤细胞只局限于局部浸润和有限生长，并不发生转移。当肿瘤组织直径超过1 mm以后，被激活的肿瘤组织通过自分泌或旁分泌方式分泌VEGF，促进肿瘤周围组织建立起丰富的毛细血管网 。
Zhang等［11］通过使用免疫组织化学、激光显微解剖法和实时定量反转录PCR，发现肿瘤衍生的VEGF可显著上调Ang?2在宿主基质细胞的表达。通过使内皮细胞转录激活的VEGF受体路径Ang?2/Tie?2的拷贝数在体内迅速增高。由于VEGF及Ang家族仅存在于血管内皮细胞，所以它们在血管生成方面起主要作用。Ang?1维持发育成熟血管的稳定是通过促进内皮细胞和周边细胞的黏连实现的，而Ang?2是Ang?1信号的天然拮抗剂。VEGF过表达的肿瘤可改变Ang?2与Ang?1之间的平衡，因为Ang?2与Ang?1竞争性结合Tie?2，所以它们的摩尔比率可以决定Angs/Tie系统的平衡。由VEGF引发的肿瘤血管生成，常伴随Ang?2表达增强，从而使Ang?2/Tie?2 比率明显增高。而在体内Ang?2与VEGF的联合作用可促使毛细血管外周细胞损伤，从而促进血管新生及肿瘤的生长。
肿瘤新生血管过表达Ang?2导致血管失去其稳定性并处于相对缺氧状态。缺氧促使血管内皮细胞生长因子的释放，导致血管增生加速。肿瘤周边组织的血管重建是肿瘤新生血管的发展所必须的［12］。有研究表明，在VEGF的协同作用下，Ang?1和Ang?2均能促进管状血管的形成,但当局部缺乏VEGF时，Ang?2则是通过抑制Ang?1的作用而使血管消退的［13］。
VEGF与Ang的协同作用在此环节中起到重要的作用。然而这些分子协同表达的机制目前还未十分明确。Scharpfenecker等［14］通过对肿瘤患者的mRNA检测表明，VEGF与Ang?2的表达呈显著相关（P<0.01），而VEGF与Ang?1、Tie?2的表达无明显相关性。通过VEGF/Ang?2的整合模型进行分析后发现，由肿瘤衍生的VEGF对缺氧、各种生长因子和各种遗传学的改变做出反应，通过VEGFR 2/KER途径上调肿瘤临近血管内皮组织的Ang?2。内皮组织以一种内分泌的方式分泌Ang?2，干扰Ang?1与Tie?2形成的相互作用，导致毛细血管周边细胞丢失及血管壁失去正常的稳定性。
虽然，对于VEGF和Ang?2在肿瘤发展及血管生成方面的机制仍不十分明确。但Yoshiji等［15］通过体内逆转录病毒四环素调节基因处理系统和传统的基因表达系统，检测到VEGF和Ang?2协同作用对肿瘤增殖的影响。在试验中发现，尽管Ang?2的过表达不能使肿瘤生长加速，但在VEGF和Ang?2同时表达时，可观察到肿瘤生长明显加速。此外，VEGFR1和VEGFR2的抗体均可明显抑制肿瘤的增长，但VEGFR2抗体抑制作用更为强。由此说明，Ang?2调节肿瘤的增殖是在VEGF的存在下发生的，且主要是通过VEGFR2级联信号途径。实验观察表明：MEK1/2和Akt参与了VEGFR2介导的使VEGF生物活性增高的下游信号的调节过程，在此过程中MEK1/2和Akt的磷酸化作用与VEGF和Ang?2协同调节使肿瘤迅速增长。
Qian等［16］报道，组蛋白脱乙酰激酶抑制剂NVP?LAQ824可抑制Ang?2/Tie?2的表达及肿瘤细胞内VEGF的表达，其与VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂PTK787/ZK222584联合使用时，比使用单一方法抑制VEGF诱导的体内外血管新生治疗效果更为明显。深入探讨VEGF与Ang?2/Tie?2对肿瘤协同作用的分子机制，可为新的肿瘤生物治疗的提出奠定基础。
展 望
肿瘤新生血管系统的发展与肿瘤周边组织的血管重建密切相关，VEGF与Ang?2协同调节起到了关键的作用。阐明Ang?2在VEGF的存在下调节肿瘤血管新生的机制，深入了解Ang?2和KDR/VEGFR2引发的信号转导通路的途径在肿瘤发展过程中的重要性，可为肿瘤治疗提供新的思路和更为有效的治疗方法，同时为研制具有我国知识产权的肿瘤生物治疗药物奠定基础，产生可观的社会效益和效益。
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