胰凝乳蛋白酶和地塞米松对儿童急性淋巴细胞白血病核转录因子?κB表达的影响及其意义
作者：安琪 薛天阳 许伟 高吉照 武怡 徐春萍
【摘要】 本研究探讨胰凝乳蛋白酶(N?tosyl?L?phenylalnylchloromethyl ketone， TPCK)和地塞米松（dexamethasone， Dex）对儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）核转录因子?κB（NF?κB）表达的影响及意义，为临床寻求以NF?κB为靶点的手段提供依据。应用SP免疫组织化学法检测20例ALL患儿NF?κB P65蛋白的表达，并检测TPCK和Dex对ALL细胞NF?κB P65蛋白活性的影响。结果显示： 40 μmol/L的 TPCK能非常显著地抑制ALL细胞中NF?κB P65蛋白的活化，作用2小时，ALL细胞中NF?κB P65蛋白表达转为阴性，阳性表达率为(2.5±1.6)%；且TPCK对NF?κB P65蛋白活性的抑制作用在一定范围内具有时间依赖性。临床治疗相关剂量的Dex 5.0 μg/ml作用于ALL细胞24小时，能非常显著地抑制NF?κB P65蛋白的表达，其阳性表达率为（25.0±3.0）％；与基础状态相比较，有显著性差异（T＝55， P＜0.01）。结论： TPCK和Dex可抑制NF?κB的活性，NF?κB活性的抑制可能是Dex作用于儿童ALL细胞的机制之一。抑制NF?κB信号传导途径可能在儿童ALL治疗中有重大价值。
【关键词】 急性淋巴细胞白血病； 核转录因子?κB； 胰凝乳蛋白酶； 地塞米松
Effect of N?tosyl?L?phenylalnylchloromethyl Ketone and Dexa?methasone on Expression of Nuclear Transcription Factor?κB in Childhood Acute Lymphoblastic Leukemia and Its Significance
Abstract In order to investigate the effect of N?tosyl?L?phenylalnylchloromethyl ketone (TPCK) and dexamethasone (Dex) on expression of nuclear transcription factor?κB (NF?κB) in childhood acute lymphoblastic leukemia (ALL) and its significance, so as to provide the experimental basis for corresponding clinical treatment of ALL, in which NF?κB is taken as a target. The biotin?streptavidin method was used to detect the expression of NF?κB P65 protein and the effects of TPCK and Dex at clinically relevant dosage on activity of NF?κB P65 protein in 20 childhood ALL patients. The results indicated that the expression of NF?κB P65 protein was strongly diminished and reached to negative level at 2 hours by treatment with 40 μmol/L TPCK, the positive expression of NF?κB P65 protein was (2.5±1.6)%. TPCK had a time?dependent inhibitory effect on ALL cells cultured in vitro. The expression of NF?κB P65 protein in ALL cells was strongly inhibited by clinically relevant concentration of dexamethasone 5.0 μg/ml for 24 hours in vitro. The positive expression was （25.0±3.0）％， there was significant difference, as compared with untreated ALL cells（T＝55， P＜0.01）. It is concluded that TPCK and Dex can inhibit NF?κB activity. Inhibition of NF?κB activity may be one of the effect mechanism of dexamethasone on ALL cells. Inhibition of NF?κB conduction pathway may have a significant value in childhood ALL treatment.
Key words acute lymphocytic leukemia; NF?κB; TPCK; dexamethasone
核转录因子?κB（NF?κB）的生物学功能十分广泛，参与炎症、免疫、应激等众多基因的表达调控，特别是近年的研究表明，NF?κB的异常表达与肿瘤的发生、密切相关，因而倍受关注［1］。当NF?κＢ被异常激活时，可改变细胞正常的信号传导，促进细胞癌变，参与肿瘤的形成发展。因此，临床上如果抑制NF?κB过度活化，便可达到治疗肿瘤的目的。我们通过凝乳蛋白酶(N?tosyl?L?phenylalnylchloromethyl ketone， TPCK)和地塞米松（dexamethasone， Dex）对儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）NF?κB表达的影响及意义的研究，为临床寻求以NF?κB为靶点的治 疗手段提供科学依据。
材料和方法
病例
20例急性淋巴细胞白血病患儿为2003年1月-2005年1月徐州医学院附属儿科及徐州市儿童医院的住院患儿，其中男15例，女5例；年龄1岁6个月-13岁，中位年龄6岁；16例为初发病例，4例为复发病例。诊断标准均按照1999年"小儿急性淋巴细胞白血病诊疗建议"［2］，所有患儿实验前至少2周未接受任何化疗药物治疗，至少1周未接受过抗生素治疗。
实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(2) 胰凝乳蛋白酶和地塞米松对儿童急性淋巴细胞白血病核转录因子?κB表达的影响及意义主要试剂
一抗(小鼠抗NF?κB P65单克隆抗体)购于Santa Cruz公司，SP免疫组织化学试剂盒和浓缩型DAB试剂盒由北京中山生物技术有限公司提供，淋巴细胞分离液购于华美生物工程公司，对甲苯磺酰?L?苯丙氨酸甲基甲酮（TPCK）和地塞米松（dexamethasone，Dex）购于美国Sigma公司。
细胞培养
取患儿化疗前骨髓2 ml或外周血4 ml（WBC＞20.0×109/L，幼稚细胞＞60％），分离单个核细胞，取50 μl细胞悬液滴于经防脱胶（10%的多聚赖氨酸）处理的玻片上或骨髓直接涂片（幼稚细胞占0.80以上），干燥，冷丙酮固定10分钟。用SP免疫组织化学法检测NF?κB P65蛋白表达率，具体步骤按SP免疫组织化学试剂盒说明书进行。选取NF?κB P65蛋白表达阳性ALL患儿，无菌条件下采集其化疗前骨髓液2 ml或外周血4 ml（WBC＞20.0×109/L，幼稚细胞＞60％），肝素抗凝，加PBS (pH 7.40) 缓冲液稀释。将稀释骨髓液或外周血液沿管壁缓缓加入并平铺于淋巴细胞分离液上方，二者体积比为2∶1， 1800×g离心20分钟。吸取中间白色的单个核细胞层。用5倍体积的PBS液稀释后， 900×g离心5分钟，洗涤2次。0.4%台盼蓝排除计数，活细胞数＞90%。制备1×106/ml细胞悬液，置含10％小牛血清的RPMI 1640完全培养液中（含青霉素100 U/ml，链霉素100 mg/ml）。
分组
上述单个核细胞分为4组。①对照组：细胞悬液； ②TPCK组：细胞悬液+TPCK，TPCK终浓度为40 μmol/L，接种于24孔培养板上，置37℃含5% CO2的饱和湿度的培养箱中培养，于培养的预定时间(0、0.5、1、 2、 6和24小时)留取50μl细胞悬液； ③Dex组：细胞悬液+Dex，Dex终浓度为5.0 μg/ml，接种于24孔培养板上，置37℃含5% CO2的饱和湿度的培养箱中培养，于培养的预定时间(0 、24小时) 留取50 μl细胞悬液； ④TPCK联合Dex组：细胞悬液+TPCK+Dex，两药终浓度同上，先以40 μmol/L TPCK培养2小时，撤药，去上清，再加入5.0 μg/ml Dex培养24小时。留取50 μl细胞悬液。
NF?κB P65蛋白表达率的SP免疫组织化学法检测
分别取4组细胞悬液50 μl，滴于多聚赖氨酸处理的防脱胶片上。操作按SP免疫组织化学试剂盒说明书进行。具体步骤如下：细胞涂片或滴片经冷丙酮固定10分钟后，用PBS冲洗3分钟，3次。3%过氧化氢孵育20?30分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水冲洗，在PBS中浸泡5分钟。滴加封闭用正常山羊血清工作液，室温孵育10?15分钟，倾去，勿洗。滴加1∶50比例稀释的一抗（小鼠抗人NF?κB P65单克隆抗体），同时以PBS代替一抗作为阴性对照，4℃过夜。用PBS冲洗3分钟，3次。滴加二抗（生物素标记羊抗小鼠工作液），37℃孵育10-15分钟。用PBS冲洗3分钟，3次。滴加辣根酶标记链酶卵白素工作液，37℃孵育10-15分钟。用PBS冲洗3分钟，3次。DAB显色剂显色。自来水充分冲洗，苏木素复染，封片。结果判定：显微镜下NF?κB P65亚单位表达阳性细胞为细胞质和细胞核均出现棕黄色颗粒。油镜下计数至少500个细胞，阳性细胞数＜5%为(-)；5%-25%为(+)；25%-50%为(++)；＞50%为(+++)。数据以均数±标准差来表示。
统计学处理
数据由SPSS统计软件处理。SP免疫组织化学实验结果用χ2检验、校正χ2检验、四格表精确概率法及Ridit分析。TPCK及Dex对NF?κB P65蛋白活性影响的实验采用Willcox检验。实验数据以均数±标准差（±SD）表示。检验水准α=0.05， P＜0.05为统计学差异有显著性。
结 果
NF?κB P65蛋白在小儿ALL中的表达
NF?κB P65蛋白表达阳性细胞为细胞质和细胞核均出现棕黄色颗粒，儿童ALL细胞其阳性表达率为85.50%（17/20）。
TPCK对NF?κB p65蛋白活性的影响
40 μmol/L TPCK作用于ALL细胞0.5小时，NF?κB P65蛋白的胞浆和胞核染色减弱，其阳性表达率为(71.0±1.6)%，但与基础状态（TPCK作用0时）相比较，其阳性表达率（78.3±7.2）%，无显著性差异（t=0.73，0.20＜P＜0.25）；作用1小时TPCK能非常显著地抑制ALL细胞中的NF?κB P65蛋白的活化，其阳性表达率为(32.1±3.2)%，与基础状态比较有显著性差异（t=3.09，P＜0.01）；作用2小时，ALL细胞中的NF?κB P65蛋白表达转为阴性，其阳性表达率为(2.5±1.6)%；TPCK作用时间增加到6小时和24小时，其阳性表达率分别为（2.3±1.9）%、（2.2±1.8）%，与TPCK作用2小时比较，无显著性差异（t值分别为0.64、1.01，P均＞0.05）（附表、图1、图2）。这些结果提示，40 μmol/L TPCK对NF?κB P65蛋白活性的抑制作用在一定范围内具有时间依赖性。
讨 论
最近研究发现，NF?κB在肿瘤的发生、中起重要作用，它可调控细胞的增殖、分化、凋亡与恶性转化［3］。通常所指的NF?κB的组成为P50-P65异源二聚体，几乎存在于体内所有细胞中。在正常情况下，NF?κB和其抑制因子IκB以非活性形式存在于各型细胞的细胞质中，只有被激活后，它才能从细胞质转位进入细胞核发挥作用。各种刺激信号如：病毒、细胞因子、氧化剂、致癌物等经不同方式使IκB降解，NF?κB得以游离、释放并进入细胞核，与多种靶基因启动区的κB位点相结合，启动靶分子的转录调控。正常情况下，NF?κB的激活是短暂的，因为IκB内也有κB位点，NF?κB的活化可以上调IκB的转录，这反过来加强了NF?κB与IκB的结合并稳定于细胞质中，防止NF?κB的过度活化，是负反馈的一部分。如果NF?κB持续存在于核内，其功能则异常活化，即称之为组成性活化（constitutive activation）。
多项研究表明，NF?κB的组成性活化与肿瘤的形成发展密切相关。我们的研究结果提示，儿童ALL细胞NF?κB阳性表达率为85.50%，与Kordes［4］的研究结果相似，NF?κB的组成性活化可能是儿童ALL的一个特异性特征，NF?κB可能在儿童ALL的发生、发展中起重要作用。
TPCK是胰凝乳蛋白酶(糜蛋白酶)类似的丝氨酸蛋白水解酶抑制剂，能抑制IκB磷酸化的水解，从而抑制NF?κB的活化。TPCK是非细胞毒性物质，不抑制细胞的代谢，而且不影响Oct?1、AP?1等其它核因子，不影响NF?κB的组成和结构，是研究NF?κB活化作用的理想抑制物［5］。国内许多学者研究证实，TPCK可以特异性地抑制NF?κB的激活［6,7］。
我们的实验结果显示，在体外实验以40 μmol/L的TPCK预培养ALL细胞后，TPCK确实可以抑制NF?κB的活化。TPCK的抑制作用在一定范围内具有时间依赖性： 40 μmol/L TPCK作用于ALL细胞0.5小时后，NF?κB P65蛋白的胞浆和胞核染色减弱；作用1小时能非常显著地抑制ALL细胞中的NF?κB P65的活化；作用2小时，ALL细胞中的NF?κB P65蛋白表达转为阴性。TPCK作用时间增加到6小时和24小时，阳性表达率与作用2小时比较，无显著性差异。这一结果提示，40 μmol/L TPCK对NF?κB P65蛋白活性的抑制作用在一定范围内具有时间依赖性。因此，我们在第4组中（TPCK联合Dex对NF?κB P65蛋白活性的影响）就选择40 μmol/L TPCK预处理ALL细胞2小时，然后再加5.0 μg/ml Dex 作用24小时。结果NF?κB P65蛋白的阳性表达率与Dex组比较有显著性差异。
糖皮质激素（glucocorticoid， GC）用于造血系统淋巴类肿瘤已多年，疗效肯定。在儿童ALL，GC是联合化疗中的一个最常用的基础的化疗药物。强的松诱导试验在判断儿童ALL预后中有着重要的意义。泼尼松试验效应不良（泼尼松每日60 mg/m2诱导7天，第8天外周血白血病细胞＞1×109/L），则是一个独立的高危因素，提示预后差。反之，则提示预后较好。一些报道，糖皮质激素，如Dex、强地松，就是NF?κB的一个非特异性抑制剂［8,9］。国内外实验已经证实，Dex可以抑制NF?κB的活化。在本实验中，我们以临床治疗相关剂量的Dex预培养ALL细胞24小时后，发现NF?κB P65蛋白的阳性表达率明显降低，但未降至阴性水平，提示Dex可以在一定程度上抑制ALL细胞中NF?κB的活性。进而我们推测，Dex对NF?κB活性的抑制，可能是其作用于ALL细胞的一个机制。这不仅进一步证实了NF?κB是儿童ALL发病中的一个重要因素，而且预示NF?κB可以为ALL新药的研究与开发提供一个有价值的标靶。目前的研究认为GC可能通过以下两种机制抑制NF?κB的活性： ①通过增强I－κBα的基因转录，上调I κBα水平，阻断NF?κB核易位以及与DNA的结合；②GC与其受体（glucocorticoid receptor， GR）结合并使之激活，活化的GR在细胞核内与NF?κB的RelA亚基直接偶联，从而抑制NF?κB的功能［10,11］。Riccaardi等［12,13］的研究认为，GC可诱导淋巴细胞表达一个称作GILZ(glucocorticoid induced leucine zipper)的新基因。这个基因超表达时，可抑制凋亡刺激因子启动的NF?κB的活化。有关这方面的工作，有待于今后进一步的深入研究。
如何在病理状态下抑制NF?κB的活性，从而达到治疗肿瘤的目的，已成为目前研究的的热点。NF?κB已成为治疗肿瘤的一个理想的靶分子［14］。目前为止，国内外有关NF?κB活化的研究主要限于实体肿瘤和成人血液淋巴系统肿瘤［15］，对小儿ALL方面的研究甚少。而有关NF?κB抑制剂对儿童ALL细胞的影响国内外鲜有报道。本研究中我们选择TPCK和Dex两种NF?κB活化抑制剂，来观察其对ALL细胞NF?κB P65蛋白活性的影响。实验结果则提示： 40 μmol/L TPCK培养ALL细胞2小时后，NF?κB P65蛋白的表达降为阴性水平，而以5.0 μg/ml的Dex预培养ALL细胞24小时后，仅部分抑制NF?κB的活性。这提示Dex除通过抑制NF?κB的活性作用ALL细胞外，还存在着其他的作用途径。如GC主要通过GR发挥对ALL细胞的作用。据文献报道，淋巴类肿瘤细胞均含有GR。GC作为一种磷脂类物质，易于通过细胞膜进入细胞，与胞浆内普遍存在的GR结合，继而类固醇－受体复合物易位进入细胞核，在细胞核内与糖皮质激素反应元件（glucorticoid response element， GRE）结合，作为转录因子而发挥作用。Tao等［10］研究认为，GC的功能部分通过GR发挥作用，部分通过对NF?κB的超抑制发挥作用。因而抑制NF?κB的活性只是Dex的作用机制之一。
NF?κB的活性在儿童ALL细胞中有较强的表达，故抑制其活性在儿童ALL治疗中有重大价值。临床上对ALL的化疗首选强烈的联合化疗，GC是最常用的一种化疗药物，选用不同作用机制的化疗药物联合NF?κB抑制剂将为儿童ALL和其他肿瘤的治疗开辟一个新的途径。
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