再生障碍性贫血患者骨髓肾素血管紧张素系统表达的研究
作者：彭敏源，赵谢兰，高欣，雷瑚仪
【摘要】 肾素血管紧张素系统（RAS）已被证明参与了骨髓造血细胞的生长增殖和分化，而再生障碍性贫血（AA）被认为是与骨髓造血细胞受损和造血微环境缺陷有关的疾病。为了探讨AA的发病机制，运用放射免疫方法检测22例AA患者骨髓和外周血肾素活性及AngⅠ、AngⅡ浓度，并以16例外周血常规和骨髓检查正常的患者为对照组，比较两组之间的差异。结果发现： AA组骨髓AngⅡ浓度低于对照组（P<0.01），AA组的骨髓AngⅡ浓度与外周血比较差异无统计学意义（P＞0.05），对照组的骨髓AngⅡ浓度较同组的外周血高（P<0.01），两组的肾素活性及AngⅠ浓度差异无统计学意义（P>0.05）。结论： AA患者骨髓AngⅡ浓度降低，AA发病可能与其有关。
【关键词】 再生障碍性贫血
Renin Angiotensin System in Bone Marrow of Patients with
Aplastic Anemia
Abstract Renin-angiotensin system (RAS) has been shown to be involved in the growth，production，proliferation and differentiation of the bone marrow (BM) hematopoietic cells，while aplastic anemia (AA) is a disease in which proliferation ability of the BM hematopoietic cells is damaged with defective hematopoietic microenvironment. To investigated the pathogenesis of AA，the rennin activity，angiotensinⅠ(AngⅠ) and angiotensin Ⅱ(AngⅡ) concentration in peripheral blood and BM of 22 AA patients were detected by radioimmunnoassay，16 nonhematological disease patients with nomal blood counts and BM picture were used as control，and the differeence between two groups was compared. The results showed that BM AngⅡconcentration in the AA patients was significantly lower than that in the control （P<0.01）. In nonhematological disease patients，AngⅡconcentration in BM was significantly higher than that in peripheral blood，the renin activities and AngⅠconcentrations were not significantly different in the two groups（P>0.05）. In conclusion，the decreased BM AngⅡconcentration in AA patients may be involved to the pathogenesis of AA.
Key words aplastic anemia; rennin angiotensin system; AngⅠ； AngⅡ; bone marrow hematopoietic cell
肾素血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)被认为是调节血压电解质的内分泌系统，然而近年发现，该系统在许多组织中（心脏、血管、肾脏和消化系统）存在旁分泌和自分泌，并参与组织器官的损伤修复。1996年Haznedaroglu等［1］首次提出骨髓中也存在RAS，并认为该系统在病理和生理条件下对骨髓（BM）造血、造血细胞的生成和增殖分化可能产生作用。目前已有研究发现，血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)能够促进放射线损伤后小鼠骨髓造血功能的恢复［2］，增强人类脐血CD34+CD38-细胞集落形成的增殖能力［3］。应用免疫组织化学方法也发现，骨髓细胞胞浆内和胞膜上有血管紧张素转化酶（ACE）的表达［4］。再生障碍性贫血(AA)被认为与造血干细胞损伤、造血微环境功能缺陷有关，但是其确切的发病机制未明，因此研究AA患者骨髓RAS的变化，有助于了解RAS在骨髓造血中及在AA发生机制上的作用。
材料和方法
对象
选取2004年7月-2005年3月在中南大学湘雅确诊为再生障碍性贫血的患者22例(AA组)，男10例，女12例，年龄15-63岁。 AA患者均为初治病例，22例中急性再生障碍性贫血8例，慢性再生障碍性贫血14例，均符合诊断标准［5］。外周血和骨髓均正常的非血液病患者16例（对照组），其中因肌营养不良健康体检患者6例，头昏乏力要求健康体检者10例，男6例，女10例，年龄12-55岁。所有患者均须排除以下情况： ①排除高血压、糖尿病、心力衰竭、严重的肝肺肾病等与RAS有关的疾病，无浮肿脱水；②排除服用ACEI（血管紧张素转化酶抑制剂）、ARB（血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂）类药或停用1周以内的患者，服用可能影响RAS的药物（如两性霉素B，β受体阻滞剂）的患者；③排除严重感染、重要脏器出血；④排除低增生性MDS、低增生性白血病、纯红细胞AA和急性AA危象。
标本的收集
两组病人均在骨髓穿刺前当天行血常规检查，并在穿刺前休息10分钟以排除紧张情绪，骨髓穿刺部位除1例再生障碍性贫血为胸骨外，其余均为髂后上棘。常规骨髓涂片后立即抽取骨髓液2 ml，注入预先加有0.3 mol/L EDTA 40 μl、8-羟喹啉 20 μl、2-巯基丙醇10 μl的聚乙烯塑料试管中，轻微摇匀。同时取患者肘静脉血2 ml，注入预先加有0.3 mol/L EDTA 20 μl、8-羟喹啉20 μl、2-巯基丙醇10 μl的聚乙烯塑料试管中，轻微摇匀。4℃冰箱静置2小时，然后500×g离心10分钟。分别取上清移入聚乙烯塑料试管并标记，置-20℃冰箱保存。每月检测1次。骨髓和外周血标本均为卧位下获取。
RAS的检测
用放射免疫分析法检测肾素活性和AngⅠ、 AngⅡ浓度，操作严格按试剂盒说明书(试剂盒由北京北方生物技术研究所提供)进行。批内变异系数（CV）<10%，批间变异系数（CV）<15%，所有样本均在湘雅医院内分泌实验室测定。
骨髓增生程度判断
骨髓增生程度依据骨髓中有核细胞的量来确定，采用5级评定法。Ⅰ级：极度活跃（有核细胞∶成熟红细胞为1∶0.5-2.0）；Ⅱ级：明显活跃（有核细胞∶成熟红细胞为1∶5-12）；Ⅲ级：活跃（有核细胞1∶成熟红细胞为1∶16-32）；Ⅳ级：减低（有核细胞∶成熟红细胞为1∶35-70）；Ⅴ级：重度减低（有核细胞∶成熟红细胞为1∶300）。
统计学处理
所有数据以均数±标准差表示，采用SPSS 11.5统计软件分析。外周全血数据为正态分布，方差齐，采用单因素方差分析。其他数据均为非正态分布，方差不齐，采用秩转换的非参素检验。骨髓增生度比较为单向有序列联表资料，采用秩和检验。骨髓和外周血RAS比较：组内比较采用配对样本比较的Wilcoxon符号秩检验，组间比较采用两个独立样本比较的Wilcoxon秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。
结 果
一般情况比较
两组研究对象的年龄、性别等一般状况差异均无统计学意义（P>0.05）。对照组外周血细胞计数与AA组差异有统计学意义（P<0.01）。
骨髓增生程度的比较
AA组患者骨髓细胞学检查均为增生减低或重度减低，对照组均为增生活跃或明显活跃。两组骨髓增生度比较，差异有统计学意义（P<0.01）（表1）。Table 1. Bone marrow proliferation degree analysis of the patients with aplastic anemia (AA) and control（略）
骨髓和外周血RAS比较
AA组骨髓和外周血中肾素活性、AngⅠ和AngⅡ浓度无明显差异(P>0.05)。对照组骨髓和外周血中肾素活性、AngⅠ浓度无明显差异(P>0.05)，而骨髓AngⅡ浓度明显高于外周血 (P<0.01)。AA组骨髓AngⅡ水平明显低于对照组(P<0.01)。骨髓肾素活性、AngⅠ水平两组间无明显差异（P>0.05）。外周血肾素活性、AngⅠ和AngⅡ水平两组间无明显差异（P>0.05）（表2）。Table 2. Peripheral blood and Bone marrow RAS analysis in aplastic anemia patients（略）
由于骨髓抽取物是骨髓和血液的混合物，因此骨髓肾素活性、AngⅠ和AngⅡ浓度可考虑是骨髓和外周血来源的总合，用骨髓肾素活性、AngⅠ和AngⅡ浓度减去外周血相应指标可能更好的代表骨髓源的肾素活性、AngⅠ和AngⅡ水平，这样可以缩小循环RAS对骨髓的影响。所以我们同时骨髓源肾素活性、AngⅠ和AngⅡ浓度。计算公式如下：骨髓源肾素活性=骨髓肾素活性-外周血肾素活性；骨髓源AngⅠ浓度=骨髓AngⅠ检测浓度-外周血AngⅠ检测浓度；骨髓源AngⅡ浓度=骨髓AngⅡ检测浓度-外周血AngⅡ检测浓度［6］。经过统计分析发现，AA组骨髓源AngⅡ水平较对照组明显降低（P<0.01），而骨髓源AngⅠ水平、肾素活性在两组中比较无显著差异（P>0.05）（表3）。Table 3. RAS gradients analysis of bone marrow in aplastic anemia patients（略）
讨论
近年来大量研究资料显示，局部存在的RAS 参与了骨髓的造血过程，并在生理和病理过程中扮演重要角色。本研究的目的是要通过检测肾素活性、AngⅠ和AngⅡ水平在骨髓和外周血中的区别来证明RAS的存在和在AA发病中的角色。
我们的研究结果显示，再生障碍性贫血组骨髓源AngⅡ及骨髓源AngⅡ浓度较对照组明显降低。这提示AA患者骨髓微环境中存在缺陷，并推断骨髓AngⅡ浓度降低可能是AA的发病机制中的重要因素。已知AngⅡ是RAS系统中最重要的生理代谢产物之一，通过与其受体AT1、AT2结合对造血干/祖细胞、红系、粒系的增殖和发育起调节作用［2，3，7］。应用RT-PCR技术已证明，不仅在人类基质细胞克隆、T淋巴细胞、B淋巴细胞上，而且CD34+CD38+、CD34+CD38-细胞上都有AT1a表达［3］，并且通过NF-κB，JAK -STAT，MAKP等细胞内信号转导途径参与基因的转录调节，促进细胞的增殖和发育 ［8-10］。AngⅡ不仅可通过旁分泌/自分泌方式直接激活造血干/祖细胞的AT1，而且还可能通过刺激骨髓间质细胞合成生长因子，进而发挥其促增殖效应［3］。故而我们推断AA患者骨髓中AngⅡ水平的降低可能使造血干/祖细胞的增殖潜力低下，形成外周全血细胞减少。近年来发现，AngⅡ还有促血管新生作用，主要通过促进VEGF受体基因的表达［11］。VEGF是目前已知最强的血管生成因子，因而AngⅡ在血管新生及肿瘤血管形成中都有重要的作用。国内王俊贤等［12］研究发现，AA患者骨髓中微血管受损，微血管数量减少，并认为通过促进AA患者骨髓中微血管增生，使骨髓血供改善，从而诱导造血组织增生，这可能会为AA的开辟一条新的道路。因此，AA骨髓中AngⅡ水平下降是否导致VEGF生成不足，使骨髓微血管生成减少，最终导致AA患者骨髓微血管数量减少，造血组织供血供养不足，致使AA发生，还有待证实。此外AA患者全血细胞减少，全身组织器官均供血供氧不足，骨髓内AngⅡ浓度下降，使血管舒张，在一定程度上对造血组织缺血缺氧有缓解作用。综上所述，AA骨髓中AngⅡ浓度降低可能从多方面多机制影响到AA的发生。临床上若能找到提高AA病人骨髓局部AngⅡ浓度的办法就有可能找到有效治疗AA的新途径。
本次实验还发现肾素活性、AngⅠ在每组骨髓与外周血及组间比较没有差别，与有关报道一致［6，13］。这提示骨髓局部是否存在肾素的旁分泌/自分泌还有待深入研究。
总之，AA是一组高度异质性疾病，本实验为我们从造血微环境角度理解AA的发生机制提供了一条新的重要线索，也为今后从造血微环境入手治疗AA提供了新的可能途径。
致谢： 本实验得到湘雅血液科骨髓室全体工作人员和内分泌科实验室李江实验员的技术支持，在此深表感谢。
【】
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