凋亡相关基因pnas?2的表达与白血病关系
作者：黄洪晖，朱坚轶，钟济华，王海嵘，钟华，韩洁英，陈芳源
【摘要】 本研究旨在探讨凋亡相关基因pnas?2与白血病的关系。应用RT?PCR技术检测硫化砷作用前后NB4、K562、U937细胞pnas?2基因的表达及急性白血病病人前后pnas?2基因表达的变化。结果显示： NB4细胞在硫化砷作用后pnas?2表达有明显下调，并呈时间依赖性；而K562及U937细胞在硫化砷作用后pnas?2基因的表达无明显变化。急性白血病病人治疗前pnas?2基因表达阳性率为100%，显著高于正常对照组；经非硫化砷诱导化疗后，完全缓解病人pnas?2基因的表达全部转为阴性；而未达到缓解的病例pnas?2基因的表达仍为阳性，较化疗前无明显变化。结论：pnas?2基因可能与硫化砷诱导APL细胞凋亡密切相关，同时其表达有可能作为急性白血病分子生物学缓解的指标之一。
【关键词】 白血病
Correlation between Expression of Apoptosis?Related Gene pnas?2 and Leukemia
Abstract The study was purposed to explore the correlation between apoptosis?related gene pnas?2 and leukemia. The RT?PCR was performed to detect the expression levels of pnas?2 gene in NB4, K562, U937 cells before and after treatment with AS4S4, and to analysis the expression change of pnas?2 gene in bone marrow cells from patients with acute leukemia before and after chemotherapy. The results showed that the expression of pnas?2 gene in arsenic sulfide treated NB4 cells was down regulated in time?dependent manner, but the same outcome in K562 and U937 cells after being treated with AS4S4 was not found. The positive expression rate of pnas?2 in cells from untreated patients with acute leukemia was 100%, and was significantly higher than that in normal control group. After chemotherapy, the expression was negative in complete remission patients, whereas in no?remission patients there were no significant differences of expression of pnas?2 before and after treatment. It is concluded that the pnas?2 gene may be closely related with apotosis of arsenic sulfide treated APL cells, and may consider as a molecular biological remission marker in acute leukemia.
Key words pnas?2 gene； Arsenic Sulfide； leukemia
pnas?2基因是细胞凋亡相关蛋白的编码基因，有资料显示它是一条与NB4细胞凋亡密切相关的基因，但尚未见具体报道。本实验室在前期工作中，用基因表达谱芯片检测NB4细胞在硫化砷作用前后基因表达的变化，结果发现硫化砷处理后的NB4细胞有34条基因表达发生改变，分别涉及细胞凋亡、细胞周期、细胞信号转导、DNA合成，转录及修复、蛋白质翻译等相关基因，其中与凋亡密切相关的pnas?2基因表达下调［1］。本实验基于基因表达谱芯片的结果，采用RT－PCR方法研究硫化砷作用于NB4、K562、U937细胞后pnas?2基因的表达变化，并检测了急性白血病病人化疗前后pnas?2基因的表达，力图进一步探索pnas?2基因与白血病的关系。
材料和方法
血液肿瘤细胞株及培养
取NB4、K562、U937细胞（NB4细胞株由上海血液学研究所陈竺所长馈赠）1×105个细胞/毫升置于不含或含10 mg/L As4S4（美国AlfaAesar公司，纯度99.99%）的新鲜培养液（RPMI 1640， Gibco公司产品）中（含10％小牛血清，1 mmol/L谷氨酰胺，1 mmol/L丙酮酸及100 U/ml青霉素，100 U/ml链霉素），于37℃、5％ CO2、湿空气中培养，2、4、6、8小时后收集细胞。
本院住院及门诊初发急性白血病病人9例，其中男6例，女3例，年龄18-57岁，中位年龄47岁，按MIC分型标准诊断，其中急性淋巴细胞白血病（ALL）1例；急性髓系白血病（AML）8例，包括M2 2例，M3 2例，M4 3例，M5 1例。诱导缓解方案为：对ALL病人采用DVP（柔红霉素，长春新碱，泼尼松）方案；AML病人采用DA（柔红霉素，阿糖胞苷）或MAV（米托蒽醌，阿糖胞苷，鬼臼噻吩甙）或CAG（阿克拉霉素，阿糖胞苷，粒细胞集落刺激因子）等方案；对M3病人采用全反式维甲酸（ATRA）治疗。以完全缓解（CR）作为判断疗效指标。对照组4例，为类白血病反应1例，特发性血小板减少性紫癜病人3例。
单个核细胞的分离
采集患者骨髓液10 ml，肝素抗凝。Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞，获得的细胞标本中白血病细胞比例均达80％以上。Ficoll分离法操作如下：抗凝骨髓4-6 ml，用等量生理盐水稀释后，沿管壁缓慢加入已放有4-6 ml Ficoll淋巴细胞分离液的试管中， 400×g室温离心20分钟，吸出单个核细胞层，用生理盐水洗涤2次。如混杂有红细胞，用4-6 ml红细胞裂解液4℃放置8分钟， 100×g离心5分钟，沉淀，加入5 ml生理盐水洗涤，用计数板计数，细胞总数。洗涤后细胞沉淀，加入TRIZOL 1 ml， -80℃冷冻保存待用。
总RNA抽提
TRIZOL总RNA抽提试剂盒购自Gibco公司。具体步骤如下：收集5×106细胞，用冰PBS洗涤1次，转移至1.5 ml的离心管内，加1 ml TRIZOL，室温孵育5分钟；加200 μl 纯氯仿，剧烈振荡15秒，室温孵育3分钟；4℃， 1 5000×g离心20分钟，取无色液体层到新管中；加入500 μl 异丙醇沉淀总RNA，混匀，-20℃放置60分钟；4℃， 1 5000×g离心20分钟；弃上清，加1 ml 75％乙醇，抽打，将沉淀打碎，混匀，4℃， 1 5000×g心20分钟；小心吸除上清液，保留RNA沉淀；空气干燥10分钟至沉淀透明；用15 μl DEPC水溶解。取1 μl RNA样品溶液，以DEPC水稀释至100 μl，置于比色杯中，于分光光度仪上检测总RNA含量及OD260/OD280比值，电泳检测RNA有无降解。
cDNA合成
逆转录试剂盒购自TaKaRa公司。RNA模板预先于70℃ 10分钟变性，立即置于冰上5分钟。整个逆转录体系50 μl，瞬时离心后，置30℃，10分钟，50℃，30分钟，5℃，5分钟进行逆转录。
聚合酶链反应
PCR试剂盒购自TaKaRa公司。 扩增引物序列及扩增片段如下： pnas?2，上游引物 5'? ACAATCTTGCCCAACAGTCATT?3'， pnas?2，下游引物 5'? TTCCCATTCCTTAGTTTTATTC?3'，pnas?2扩增片段为722 bp。
内参照引物序列及扩增片段如下： β?actin，上游引物 5'? TCGACAACGGCTCCGGCAT?3'， β?actin，下游引物 5'? AAGGTGTGGTGCCAGATTTTC?3'，β?actin扩增片段为241 bp。
PCR反应体系共50 μl： 2×mRNA Selective PCR Buffer Ⅱ 20 μl，MgCl2 8 μl，dNTP 4 μl， AMV－optimized Taq 1 μl，pnas?2 上游引物 1 μl，pnas?2 下游引物1 μl，β?actin上游引物0.5 μl，β?actin下游引物0.5 μl，cDNA 5 μl，灭菌水9 μl。瞬时离心，置于PCR扩增仪上，85℃低温变性，进行35个循环，循环条件： 85℃变性45秒，55℃退火45秒，72℃延伸90秒，最后延伸7分钟结束反应。
PCR产物电泳
PCR产物6 μl在1.5％琼脂糖凝胶中电泳后，置紫外灯下观察、成像，记录于凝胶数字成像系统，分别测定pnas?2和β?actin基因扩增产物的光密度值，计算pnas?2基因和β?actin基因的相对比。
结 果
10 mg/L As4S4作用NB4 、K562、U937细胞后pnas?2基因的表达变化
结果如图1、2、3所示，由图可见10 mg/L As4S4作用NB4、K562、U937细胞2、4、6、8小时后pnas?2基因的表达变化不同，具体表现在NB4细胞在硫化砷作用后pnas?2表达有明显下调，并随着硫化砷作用时间的延长，pnas?2基因的表达呈下降趋势，而K562及U937细胞在硫化砷作用后pnas?2基因的表达无明显下调，作用时间延长对pnas?2基因的表达亦无显著影响。
急性白血病病人前后pnas?2基因表达的动态变化
9例急性白血病病人中，治疗前pnas?2基因表达阳性率为100%，而正常对照组为25%，两组间存在显著性差异（p<0.01）。经诱导化疗后，6例病人达CR，pnas?2基因的表达全部转为阴性；而另外3例化疗后未达到缓解的病例，其pnas?2基因的表达仍为阳性，较化疗前无明显变化（附表）。
讨 论
随着人类基因组草图的公布及相关基因库的建立，已证实白血病的发生和与多种相关基因表达失常或许多肿瘤抑制基因失活有关，如PML?RARα基因与急性早幼粒细胞白血病发病、bcr/abl基因与慢性粒细胞白血病发病的确切关系等均证实了这一推断。
pnas?2是新近发现的一条与NB4细胞凋亡密切相关的基因，GenBank： AF229832，最长的开放读框在Frame＋3处，即cDNA序列的27-422，共长
396个碱基，可能编码1个长131个氨基酸序列的蛋白质，其分子量：14441.947 道尔顿，等电点：3.675。该基因长为751 bp，但为partial cds，有加尾信号AATAAA（702-707）和polyA尾巴。它定位于9号染色体，与BAG1（bcl?2 associated athanogene）基因处于染色体的相邻位置。据报道，BAG1基因是凋亡抑制基因，其蛋白产物能与bcl?2家族的其他成员蛋白，Raf?1激酶，酪氨酸激酶生长因子受体，类固醇激素受体相互作用，并可能参与调节HSP70/HSC70的表达［2］，目前其蛋白结构和生物学功能不详。
近年来随着含砷化合物，尤其是三氧化二砷（arsenic trioxide, As2O3）治疗急性早幼粒细胞白血病临床上取得的突出成效，雄黄作为毒性更小的含砷化合物在治疗白血病中的价值再次受到重视。北京陆道培等［3］一项长达6年之久的研究成果更令人鼓舞，129位接受四硫化四砷治疗的APL病人，初次治疗病人3年无病生存率为76.6％，维持治疗病人6年无病生存率可达87.4％；19例初次治疗病人，用药1个月后，体内的早幼粒细胞和原始粒细胞数量就开始减少，残留的早幼粒细胞不再分化，出现了退行性变和凋亡的形态学改变。白月辉等［4］在研究雄黄的作用机制时证实雄黄对NB4、HL?60细胞有促进凋亡的作用。张晨等［5］进一步研究发现，低剂量雄黄作用于NB4细胞的早期主要以诱导细胞凋亡为主，未见明显分化现象。由此可见，雄黄治疗白血病以诱导凋亡为主，但具体机制复杂。
本实验室在前期开展的体外实验也证实10 mg/L浓度的As4S4与NB4、K562、U937细胞共同孵育, As4S4对3种细胞株的生长均有抑制作用；作用8小时后均开始出现凋亡细胞的特征性改变，胞膜完整、核染色质固缩、细胞核碎裂、形成凋亡小体，但没有分化迹象；12小时后流式细胞仪检测3种细胞株均出现明显的凋亡细胞群，即G1峰前出现亚二倍体峰，凋亡细胞百分比分别为12.41%、7.48%、5.08%。增加As4S4浓度后的细胞在作用8小时后已经出现胞膜不完整，甚至是死亡细胞；降低As4S4浓度后即使延长作用至72小时，3种细胞株均未出现明显的生长抑制。叶启东等［6］研究也发现As4S4能有效地通过诱导凋亡抑制K562细胞生长，与本实验室结果一致。
本实验中我们应用RT?PCR技术检测10 mg/L As4S4作用NB4 、K562、U937细胞后pnas?2基因的表达变化，结果显示As4S4作用NB4、K562、U937细胞2、4、6、8小时后pnas?2基因的表达变化不同，其中NB4细胞在硫化砷作用后pnas?2表达有明显下调，并随着硫化砷作用时间的延长，pnas?2基因的表达呈下调趋势，与基因表达谱芯片的结果是一致的；而K562及U937细胞在硫化砷作用后pnas?2基因的表达无明显下调，作用时间延长对pnas?2基因的表达而无显著影响。
结合基因表达谱芯片及RT?PCR结果，硫化砷能够下调pnas?2基因在NB4细胞株的表达，而在对U937、K562细胞的研究中并未发现类似的变化。同时本实验室在进一步的研究中发现，接受砷剂诱导治疗缓解的3例APL病人中，应用实时定量PCR方法检测治疗前后pnas?2基因的表达，用delta delta CT值表示pnas?2基因相对含量，治疗前分别为?4.109、?2.344、?5.355，治疗达CR后其相对含量分别为2.151、1.845、?2.590，提示APL病人经砷剂治疗后pnas?2基因的表达显著下降，与我们的体外实验结果相一致。因此我们推测硫化砷诱导APL细胞凋亡的过程中，与凋亡相关的pnas?2基因的下调可能与其密切相关。
但就目前的资料显示，不论全反式维甲酸还是砷剂治疗APL的作用靶点都在PML?RARα融合基因，且我们在硫化砷作用于NB4细胞株的基因表达谱筛选中发现另外33条基因表达有显著变化，有关这些基因在硫化砷诱导凋亡的过程中所起的作用如何，以及pnas?2基因是否是硫化砷抗APL的独立因素，还是与其它基因如PML?RARα等共同作用的结果，还有待进一步深入研究。
本实验同时对急性白血病病人治疗前后pnas?2基因表达进行了观察，结果显示9例急性白血病病人中，治疗前pnas?2基因表达阳性率为100%，显著高于正常对照组；经诱导化疗后，6例病人达CR，pnas?2基因的表达全部转为阴性；而另外3例化疗后未达到缓解的病例pnas?2基因的表达仍为阳性，较化疗前无明显变化。另外本实验室进一步检测了10例结肠癌病人外周血单个核细胞、肿瘤组织和正常组织中pnas?2基因的表达，发现该基因的表达在同一病人的各组织样本中无明显差异，且显著低于急性白血病的表达水平。提示pnas?2基因的表达可能是急性白血病所特异的，可以作为急性白血病分子生物学缓解的指标之一，但因病例数较少，还有待于更多的实验数据证实。
【文献】
1顾春红，陈芳源，韩洁英等. 硫化砷作用后NB4细胞基因表达谱变化的研究. 中华血液学杂志，2002; 23：16-18
2Takayama S, Krajewski S, Krajewska M, et al. Expression and location of Hsp70/Hsc?binding anti?apoptotic protein BAG?1 and its variants in normal tissues and tumor cell lines. Blood, 2000; 95: 3929
3Lu DP, Qiu JY, Jiang B, et al. Tetra?arsenic tetra?sulfide for the treatment of acute promyelocytic leukemia: a pilot report. Blood, 2002;99: 3136-3143
4白月辉，黄世林. 雄黄对NB4及HL?60细胞的促凋亡作用. 中华血液学杂志，1998; 19: 477-480
5张晨，黄世林，向阳等. 低剂量雄黄诱导NB4细胞凋亡的研究. 中医基础医学杂志，2000; 6: 11-13
6叶启东，顾龙君，赵艳霞等. 四硫化四砷诱导K562细胞凋亡的机制研究. 中国实验血液学杂志，2005； 13：759-763
