低温保存对白血病源性树突状细胞的影响
作者：黄友章，沈建良，王立新，向丹，郑培浩，岑坚，宫立众，刘毅，杨平地
【摘要】 本研究观察低温保存对白血病源性树突状细胞(L?DCs)的生物学特性和功能的影响。 取急性、慢性髓系白血病骨髓细胞，将其一部分细胞立即检测，一部分细胞立即培养，一部分细胞加入细胞保护剂低温保存一定时间复温后培养。细胞培养时，在细胞培养体系内加入组合细胞因子并培养12天，然后分别检测3组细胞的细胞形态、细胞免疫表型、混合淋巴细胞反应及细胞毒T淋巴细胞(CTL)效应，并对结果进行相互比较分析。结果表明： 在细胞形态学方面，急性、慢性髓系白血病患者骨髓细胞在不染色或在瑞氏染色下仅见白血病细胞，而未观察到"树突状"细胞，但经组合的细胞因子培养后，均出现了"树突状"形态的细胞，低温保存前、后二者比较，无明显差异；在细胞表面免疫标志表达方面，经组合细胞因子培养的细胞与未培养的细胞相比，细胞表面表达的CD80、CD54、HLA?DR、CD1a、CD83、CD86明显上调，而CD14表达则明显下调，低温保存前、后的细胞在上述几种细胞表面免疫表达指标方面相比较无明显差异；低温保存后的白血病细胞经培养后，不仅有明显的混合淋巴细胞反应，而且在与T细胞作用后T细胞表面抗原CD8和CD25免疫标记细胞明显增多，明显地表现了CTL杀伤自体白血病细胞的效应。结论： 髓系白血病细胞在组合细胞因子培养条件下，可诱生为L?DC；L?DC的诱生在生物学特性方面不受低温保存的影响。
【关键词】 白血病细胞
Influence of Cryopreservation on Leukemic Dendritic Cells Derived from Leukemia Patients
Abstract This study was aimed to investigate the influence of cryopreservation on biological properties and function of leukemic dendritic cells(L?DCs) derived from patients with acute or chronic leukemia. Some fresh leukemic cells were detected immediately; some were cultured immediately; some were cryopreserved in ?80℃ with 5% DMSO-6% HES as cryopreservor. After being thawed , they were cultured. The combination of rhGM?CSF, rhIL?4, rhTNF?α and other cytokines were added into the culture system. 12 days later, L?DCs were assayed for morphology, immunophenotype, mixed lymphocytic reaction (MLR) and CTL cytotoxicity on autologous leukemic cells. The results showed that both fresh and cryopreserved leukemic cells obtained from patients with acute or chronic leukemia revealed typical DC morphologically by means of using combinations of cytokines in culture, but there was no significant difference between pre?or post cryopreservations. L?DCs also upregulated the expression of CD80, CD54, HLA?DR，CD1a, CD83 and CD86, and downregulated the expression of CD14, but there was also no difference as compared with L?DCs befor cryopreservation. L?DCs derived from leukemic cells were also capable of stimulating MLR and inducing CTL which could kill autologous leukemic cells obviously. It is concluded that leukemic cells, regardless of fresh or frozen, can induce L?DCs after culture with cytokine combination. The L?DCs can induce CTL targeting autologous leukemic cells, and may be used to treat MRD as immunotherapy. The induction and biological properties of L?DCs are not influenced by cryopreservation.
Key words leukemic cell; dendritic cell; cryopreservation
白血病化疗后的复发率高达90％以上，即使造血干细胞移植后也有一定比例的复发，复发原因是因为存在微小残留病（MRD）。针对MRD的，目前有化疗、免疫治疗等手段，其中树突状细胞（DC）介导的过继免疫治疗最具特异性和应用前景［1］，已知白血病细胞在细胞因子作用下可诱导生成DC，这种白血病源性树突状细胞(L?DC)既能表达白血病抗原，又具有致敏T淋巴细胞的作用。致敏的T淋巴细胞可特异性杀灭白血病细胞。然而，在白血病初发时，由于白血病细胞多，肿瘤负荷大，免疫功能差等因素的影响，应用L?DC治疗疗效差，如果在病人获完全缓解后，其体内白血病细胞已十分稀少，细胞免疫功能等也基本恢复，此时应用DC治疗MRD疗效应该明显。DC虽然可低温保存，但其功能会受到一定损伤［2］，若能在治疗前将白血病细胞先期保存，待白血病取得完全缓解时，复苏白血病细胞并诱生为DC，用自身DC进行过继免疫治疗，临床应用会十分方便，但急性、慢性髓系白血病细胞低温保存后诱生的白血病源性树突状细胞的功能如何？未见报道，本研究试图观察低温保存白血病细胞对白血病源性树突状细胞(L?DC)生物学特性和功能方面的影响。
白血病细胞来源与分组
经临床、血液检查、骨髓细胞形态学、免疫学、遗传学、分子生物学标准确诊的初发髓系白血病18例(M0 1例， M1 3例， M2 2例， M3 2例， M4 3例， M5 2例， M6 2例， CML 3例），研究用骨髓25例，其中2例在培养中失败，5例患者在治疗过程中骨髓未达到完全缓解)。在肝素抗凝下抽取患者骨髓>30 ml，一部分细胞立即检测(C组)，一部分细胞立即进行L?DC诱导培养(T1组)，另一部分细胞低温保存，在患者白血病完全缓解时复温细胞后进行L?DC诱导培养(T2组)。采集时患者的骨髓细胞形态分类： M0、M1、M2、M3和M4的原始粒细胞、早幼粒细胞占73.25%（36%-89%），淋巴细胞占4.75%（3%-10%）；M4和M5的原始粒细胞、幼稚单核细胞占45.6%（32%-71%），淋巴细胞占2.2%（1%-3%）；M6的原始粒细胞、早幼粒细胞占27%（25%-29%），原始、早幼红占14%（13%-15%），淋巴细胞占4%；CML的原始粒细胞、早幼粒细胞占5%（4%-7%），中幼粒细胞占37.3%（20%-50%），淋巴细胞占3%（2%-4%）。
细胞保护剂、白血病细胞低温保存与复温
取二甲亚砜10 ml、羟乙基淀粉12 g、白蛋白20 g、加入RPMI 1640培养液（Gibco公司产品）内至100 ml，4℃冰箱预冷作为细胞保护剂。取白血病患者骨髓，将有核细胞调整至1×1010/L，置4℃冰箱1小时，缓慢加入等体积的保护剂，使二甲亚砜终浓度5%（V/V）、羟乙基淀粉终浓度6%(W/V)、白蛋白终浓度10%(W/V)。分装于聚丙烯小管(2毫升/管)，置?80℃冰箱过夜，液氮液相中保存。待检定时，取出细胞小管，放入40℃水浴复温，小管内细胞全部融化后立即吸出细胞悬液，以5倍含10%胎牛血清(FCS)的RPMI 1640培养液稀释， 400×g离心10分钟，去上清，洗涤1次，制成细胞悬液。
L?DC的诱导培养［3］和自体原代白血病细胞培养
取上述患者低温保存前、后的骨髓细胞，用细胞分离液(1.077 g/cm3)分离，收集单个核细胞(MNC)，离心洗涤3次，用含10% FCS的RPMI 1640培养液制备MNC悬液(细胞形态分类： M0-M5患者的原早幼细胞>90%，M6患者的原早幼细胞>75%，CML患者原早幼粒细胞>45%)。将MNC移入组织培养瓶(80 ml， Costar)中，每瓶20 ml(3×109/L)，37℃、5% CO2条件下培养2小时，收集非黏附细胞，在5毫升/瓶(2×109/L)细胞中加入rhGM?CSF(1×107U/L，先灵葆雅)、rhIL?4(5×106U/L， PeproTech EC)、20%FCS的RPMI 1640培养液，从第8天起，再加入rhTNF?α(5×104U/L，PeproTech EC)和LPS(1×104 ng/L，Sigma)，在培养全过程中隔日半量换液，37℃、5% CO2条件下培养12天。不加细胞因子者为自体原代白血病细胞培养。
细胞形态及细胞表面免疫表型检测
从培养第1天起至培养结束，逐日在倒置显微镜下低倍镜观察培养细胞。定期取培养细胞，离心涂片，瑞氏染色，油镜下观察。将有膜性面纱状、梭状或扁平状突起的细胞定为"树突状"细胞。流式细胞仪(Epics XL?AD2517, Beckman Coulter)检测细胞表面免疫表型，CD80、CD54、CD1a、CD83、CD86、CD14、CD3、CD4、CD8、、CD19、CD56、CD25和HLA?DR单克隆抗体均为PharMingen公司产品。
混合淋巴细胞培养和MTT检测［2］
混合淋巴细胞培养 在白血病完全缓解期取患者外周血20 ml，肝素抗凝，用细胞分离液(1.077g/cm3)分离出单个核细胞，离心洗涤3次，37℃、5% CO2条件下培养2小时，取非黏附细胞，用含20% FCS的RPMI 1640培养液配制淋巴细胞悬液备用。
收集上述经L?DC方法培养的L?DC和生长良好的自体原代白血病细胞，加入丝裂霉素C(0.0025 mg/ml),37℃孵育20分钟，洗涤3次，用含10%FCS的RMPI 1640培养液悬浮，分别称L?DC实验细胞和自体原代白血病实验细胞。
MTT检测 实验分为： ①单纯淋巴细胞组：仅含淋巴细胞。②单纯L?DC实验细胞组：仅含L?DC实验细胞；③单纯自体原代白血病实验细胞组：仅含自体原代白血病实验细胞；④L?DCs实验细胞加淋巴细胞组：含L?DCS实验细胞与自体淋巴细胞；⑤自体原代白血病实验细胞加淋巴细胞组：含自体原代白血病实验细胞与自体淋巴细胞。
上述各组终体积为200 μl(96孔平底培养板，每组复孔3个)，37℃、5% CO2条件下培养72小时，进行MTT实验：每孔加入MTT(0.5 g/L，Fluka)溶液20 μl，再孵育4小时终止培养， 400×g离心5分钟，弃孔内培养液。每孔中加入DMSO(150 μl)，振荡10分钟，用酶联免疫仪(490 nm)测定各孔OD值。为了表达方便，根据各组OD值的不同，我们设计了以剌激指数表示。
L?DC的混合淋巴细胞反应的剌激指数为： L?DC实验细胞加淋巴细胞组OD值?(单纯淋巴细胞组OD值+单纯L?DC实验细胞组OD值)/(单纯淋巴细胞组OD值+单纯L-DC实验细胞组OD值)。
自体原代白血病细胞（A?LC）的混合淋巴细胞反应的剌激指数为：自体原代白血病细胞加淋巴细胞组OD值?(淋巴细胞组OD值+自体原代白血病细胞组OD值)/(淋巴细胞组OD值+自体原代白血病细胞组OD值)。
细胞毒T淋巴细胞效应［3］
CTL诱导 取患者白血病完全缓解期的外周血淋巴细胞，用何学鹏等［6］报道方法分离T细胞。在1×106/ml的淋巴细胞内加入含rhIL?2( 200 U/ml，远策药业公司产品)的20% FCS的RPMI 1640培养液，5毫升/瓶，37℃，5% CO2条件下，隔日半量换液，培养5天收集T细胞。
实验分组 ①TC组：仅为T细胞；②L?DC组:仅为L?DC；③L?DC+TC组：T细胞内加入L?DC(3∶1)；④A?LC+TC组：T细胞内加入生长良好的自体原代白血病细胞(3∶1)。 上述各组细胞继续在含rhIL?2的PRMI 1640培养液中培养，第3天半量换液，第5天用不加rhIL?2的培养液半量换液，第7天时，检测各效应细胞的细胞表面标记，收集各组细胞为效应细胞。
CTL效应测定 取对应患者生长良好的2×106自体原代白血病细胞，加200 μ Ci铬酸钠，37℃孵育1小时，离心洗涤3次，即靶细胞。按不同效靶比加入效应细胞和靶细胞，终体积200 μl，每组3个复孔，培养5小时后， 400×g离心5分钟，取100 μl上清液测cpm值。设自发释放孔（1.0×104靶细胞加培养液）、最大释放孔（1.0×104靶细胞加蒸馏水），结果以3孔均值表示。按下述公式各组杀伤活性：
杀伤活性(%)=（实验孔cpm-自发释放孔cpm）/（最大释放孔cpm-自发释放孔cpm）×100
数据处理
采用STATA 4.0统计分析软件进行配对或独立t检验分析，各组值以±SD表示。
结 果
不染色倒置显微镜下观察
18例患者骨髓原代白血病细胞经L?DC诱导培养，在5天左右，均有较多“树突状”细胞和细胞簇出现，9天形成较多，继续培养至12天，未见明显增多。低温保存复温后的原代白血病细胞经L?DC培养后，5天同样出现"树突状"细胞和细胞簇，10天形成较多，继续培养至12天，也未见增多。这种“树突状”细胞在立即检测的C组中未检测到，比较保存前的T1组与保存后的T2组培养细胞的细胞形态和细胞数，二者差异不明显，倒置显微镜下“树突状”细胞形态见图1。
Figure 1. Dendritic cells cultured for 12 days observed by iverted microscopy (40×10 ).
瑞氏?吉姆萨染色形态分类
白血病细胞立即（T1组）或低温保存复温后（T2组）经L?DC培养12天后，细胞涂片，瑞氏?吉姆萨染色，分类计数，100%为“树突状”细胞，并未见到培养前的那种白血病细胞，T1组与T2组比较，差异不明显，而这种“树突样”细胞在立即检测的C组中未检测到，瑞氏?吉姆萨染色“树突状”细胞见图2。
Figure 2. Dendritic cells cultured for 12 day (Giemsa's staining, 100×10).
细胞表面抗原
T1组细胞或T2组细胞，经L?DC培养12天后，细胞表面抗原发生了明显改变，T1组或T2组的细胞表面抗原与C组细胞的表面抗原相比，其CD1a、CD83、CD80、CD86、CD54、HLA?DR的表达均明显上调，而CD14的表达则明显下调， T1组与T2组比较差异不明显（表1）。
混合淋巴细胞反应
白血病初发时，血液内白血病细胞占优势，一般无法分离患者自身淋巴细胞，所以培养出的T1组L?DC也就无法进行混合淋巴细胞培养实验；只有在白血病完全缓解(CML为慢性期)，淋巴细胞恢复正常时，才能获取患者自身淋巴细胞。此时复温低温保存的白血病原代细胞（T2组），一部分细胞经L?DC培养，一部分细胞不加任何细胞因子直接培养，获得细胞，对患者的自身淋巴细胞进行混合培养。结果显示：混合淋巴细胞培养体系内加入经L?DC培养的细胞，淋巴细胞表现有明显的剌激反应（剌激指数明显增高），而未加组合细胞因子培养的原代白血病细胞（A?LC）对淋巴细胞未表现出剌激反应（剌激指数未见明显变动）（图3）。
细胞毒T淋巴细胞效应
和混合淋巴细胞培养同理，经L?DC培养的细胞与
Figure 3. Mixed lymphocyte reaction (±SD). A?LC： antologus leukemic cells. L?DC: leukemic dentritic cells.
白血病完全缓解期的T细胞作用后，T细胞表面抗原的表达发生了明显改变，CD8和CD25的免疫标记细胞明显增多，而未经L?DC培养的白血病细胞与这样的T细胞作用后，T细胞表面抗原的表达未发生改变（表2）。这种细胞表面抗原表达发生了明显改变的T细胞与自身原代白血病细胞作用后，自身原代白血病细胞活力明显降低，表现出细胞毒T淋巴细胞效应，而未发生改变T细胞对自身原代白血病细胞活力未见影响（图4）。
讨 论
急性、慢性髓系白血病细胞通常是指有典型细胞形态的原始粒细胞、早幼粒细胞或原始单核细胞、幼稚单核细胞，它们多不具备只有DC才能高表达的主要组织相容性复合物分子（HLA?Ⅰ类和或Ⅱ类）、CD80、CD86、CD40、CD83和CD1a，也不表现只有具备抗原性的细胞才有的混合淋巴细胞反应，更没有DC呈递特异性CTL反应。在本实验中，成功地在组合细胞因子作用下进行培养的急性、慢性髓系白血病细胞有18例，培养细胞内未再见到原始粒细胞、早幼粒粒细胞或原始单核细胞、幼稚单核细胞，而出现了典型的DC形态，细胞表面的CD80、CD54、HLA?DR、CD1a、CD83、CD86表达上调，CD14表达下调。可以初步认为，这些细胞具备了DC的特点，是由白血病细胞转化而来的DC。白血病细胞经低温保存复温后培养生成的L?DC，在细胞形态和细胞表面抗原表达方面，与未经过低温保存的白血病细胞来源的L?DC比较，差异不明显。低温保存复温后的白血病细胞培养生成的DC，还表现有两方面的作用：一是有明显的混合淋巴细胞反应，说明这种DC有明显的抗原性；二是与T细胞作用后，T细胞表面抗原CD8和CD25的表达明显增高，这种T细胞能杀伤自身白血病细胞，表现了DC特异的呈递功能。所有这些均提示了低温保存对白血病源性DC的诱导无明显影响，同时也进一步证实了L?DC所具有的生物学特性和功能。
Steinman和Cohn在1973年首次发现抗原呈递细胞DC以来，相继有人认为，慢性髓系白血病细胞和急性白血病细胞在细胞因子的作用下亦能向DC分化，这样的DC具有很强呈递白血病相关抗原的能力，可诱导抗白血病免疫反应［5，6］。多能造血干细胞与白血病克隆共存于骨髓，成功的抗白血病后，虽然骨髓正常造血干细胞的造血功能得以恢复，但大多数病例仍存在少量白血病克隆，这些白血病克隆是复发的根源。因此，化疗后白血病缓解可能是暂时的，白血病治疗的挑战就在于防止复发，人们试图在体外诱导AML细胞分化成DC，将L?DC用作体内抗白血病疫苗或先在体外生成抗白血病T细胞（CTL）再用于病人，通过这种过继免疫治疗，以达到消除MRD，进而获得持久缓解［7］。
尽管DC回输疗法已试用于白血病等晚期患者的治疗［1］，取得良好的临床疗效,但DC用于肿瘤免疫治疗大多仍处于实验研究阶段，随着人们对DC分化调控及活化机制研究的深入，DC作为肿瘤免疫治疗的一种有效手段，必将得到广泛的临床应用。
【】
1陈虎，楼晓，江岷等. 树突状细胞介导的抗白血病效应的临床研究.实验血液学杂志,2005;13:412-416
2黄友章，杨平地，沈建良等. 低温保存对脐血树突状细胞的生物特性的影响. 中国应用生杂志,2003; 19：350-353
3沈建良，黄友章，杨平地等. 人脐血树突状细胞体外诱导抗白血病细胞毒效应. 中国实验血液学杂志,2004; 12:503-507
4何学鹏，尤胜国，卞寿庚等. 急性髓系白血病患者树突状细胞诱导抗自身白血病细胞免疫的实验研究.中华血液学杂志，2001; 22：629-632
5Choudhury A, Gajewski JL, Liang JC, et al. Use of leukemic dendritic cells for the generation of antileukemic cellular cytotoxicity against philadelphia chromosome?positive chronic myelogenous leukemia. Blood, 1997; 89: 1133-1142
6Robinson SP, English N, Jaju R, et al. The in vitro generation of dendritic cells from blast cells in acute leukemia. Br J Hematol,1998;103:763-771
7Choudhury BA, Liang JC, Thomas EK, et al. Dendritic cells derived in vitro from acute myelogenous leukemia cells stimulate autologous, antileukemic T?cell responses. Blood, 1999; 93: 780-786
