应用人类全基因组芯片检测多药耐药白血病细胞株HL-60／VCR与敏感细胞株HL-60基因的表达差异
作者：董宝侠，陈协群，王哲，梁蓉，白庆咸，黄高昇，张伟平，高广勋，韩冬梅
【摘要】 本研究利用基因芯片技术检测白血病多药耐药细胞株HL-60／VCR及其亲本细胞株差异基因表达谱，探讨急性白血病多药耐药机制。本试验提取白血病细胞株HL-60及其多药耐药细胞株HL-60/VCR的 mRNA，在反转录及体外转录过程中分别用生物素进行标记，与Affymetrix公司人类全基因组芯片U133A杂交，用Affymetrix专用芯片扫描仪G2500A GeneArray Scanner及Microarray Suite 、Micro DBTM GeneChip LIMS、GeneChip DMT分析软件系统处理杂交信号获取结果。结果表明：白血病细胞株HL-60及其耐药株HL-60/VCR差异显示基因5 507条，其中耐药细胞株中上调表达基因3 100条，下调表达基因2 407条；差异极显著性基因 1 040条，表达上调435条，下调605条，涉及与细胞生长活动及信号转导相关的基因。结论：多基因参与白血病细胞株的多药耐药机制，基因芯片技术是并行分析多个基因、探讨白血病多药耐药机制的有效方法。
【关键词】 基因芯片
Difference of Gene Expression Profiles between HL-60/VCR and HL-60 Cells Detected by Human Genome Genechip
Abstract This study was aimed to detect the gene expression profile changes between human acute leukemia cell line HL-60 and VCR-resistance HL-60，and to investigate the underlying mechanisms of MDR by using genechip technology. In experiments，mRNA were harvested using TrizoL reagent from these two cell lines，through RT-PCR，the biotinylated nucleotide were incorporated into the cRNA during the in vitro transcription reaction. The high quality RNA was hybridized to the gene expression array ——human genome U133A developed by Affymetrix. It was scanned by G2500A GeneArray Scanner and the acquired image was analysed by a series of softwares. The results showed that 5 507 genes were differentially expressed between human acute leukemia cell line HL-60 and VCR-resistant HL-60. Compared with HL-60，3 100 genes were up-regulated and 2 407 genes were down- regulated in VCR-resistant cell line. These genes were involved in different cell activities such as growth regulation and signal transduction. Among the genes with remarkable differential expression between the two cell lines，435 were up- regulated and 605 were down- regulated. It is concluded that many different kinds of genes are involved in the mechanism of MDR and there is an intricate molecular network that controls the sensitivity of leukemia cells to the chemotherapeutic agents. Genechip is an efficient tool for parallel gene expression analysis.
Key words genechip; multidrug resistance; leukemia; HL-60; HL-60/VCR
基因芯片技术是近年来机技术与生物学技术交叉的产物。它通过使用微加工、微技术及其他相关技术，在固体表面合成大量探针，利用生物大分子DNA的结构及其碱基配对原则，实现对核酸分子中基因片段的准确、快速、大信息量的检测。化疗是急性白血病的主要手段，而白血病细胞对化疗药物的原发或继发耐药是导致化疗失败的根本原因。白血病的多药耐药现象是导致白血病复发及化疗失败的主要原因。目前发现的肿瘤多药耐药机制主要涉及P-gp﹑MRP﹑LRP﹑BCRP、GSH/GST﹑PKC、TopoⅡ、DNA修复、多种凋亡相关基因和肿瘤细胞生活的内外环境（如pH、缺氧、温度）变化。但白血病MDR的机制并非单一，它错综复杂，以的形式相互作用并相互制约，且在临床上根据现有的MDR机制采取的逆转耐药措施并不十分有效。基因芯片为我们提供了进行观察、分析不同种类基因与白血病耐药相互关系的平台，为进一步探讨肿瘤耐药机制、临床寻求有效逆转耐药方法创造了条件。我们选用Affymetrix公司人类全基因组芯片U133A［8］，对急性白血病耐VCR细胞株与其亲本细胞株差异表达基因进行筛选和分析。
材料和方法
药品
长春新碱（VCR）购自美国Sigma公司，柔红霉素、阿糖胞苷购自 Pharmacia-Upjohn公司，拓朴替康为贵州汉方制药厂产品，米托蒽醌为四川升和制药有限公司产品，羟基喜树碱为黄石飞云制药厂产品，足叶乙甙为连云港制药厂产品。以上药物用无菌生理盐水稀释、过滤并分装，-20℃保存备用。PgP单克隆抗体为Immunotech公司产品，TrizoL为Gibco公司产品，基因芯片HU-133A购自Affymetrix公司，其上包括18 000个明晰的转录本。
细胞培养
急性髓细胞白血病细胞系HL-60系ATCC细胞株为本校病理教研室保存株。HL-60耐长春新碱（VCR）细胞株HL-60／VCR由美国纽约 Memorial Sloan-Kettering癌症研究所引进，培养于含10％ 灭活小牛血清的RPMI 1640培养液（含青霉素、链霉素各0.1 U/L）中，置于5％ CO2、饱和湿度、37℃培养箱中悬浮培养。2-3天换液1次。HL-60／VCR细胞培养液中VCR浓度为250 ng/ml，实验所用细胞均为脱离药物驯化2周后的对数生长期细胞。
HL-60／VCR优势克隆的有限稀释法挑选
调整HL-60／VCR细胞浓度至5×103 ／ml，将此悬液经100倍稀释，即为50细胞／毫升；再将50细胞／毫升的细胞悬液经5倍稀释，即为10细胞／毫升；最后将10细胞／毫升的细胞悬液经2倍稀释，即为5细胞／毫升。将3种稀释好的细胞悬液分别接种于96孔板中，每孔加液0.1 ml，然后放入培养箱内培养。
HL-60／VCR细胞株的体外药物敏感试验
采用MTT 细胞毒实验法。 对照组为HL-60细胞，处理组为HL-60/VCR，调整细胞浓度为2×104／ml，按每孔100 μl，接种于96孔板，37℃、5﹪ CO2孵育过夜，次日加入含不同浓度药物的培养液100 μl。化疗药物分别以1 ng/ml、3.2 ng/ml、10 ng/ml、32 ng/ml、100 ng/ml、320 ng/ml、1000 ng/ml、3 200 ng/ml、10 000 ng/ml、32 000 ng/ml浓度分为10组，每组设4个平行孔。加药后培养72小时，每个孔加入MTT(5 g/L) 20 μl，继续孵育4小时，离心，去上清，每孔加入150 μl二甲亚砜（DMSO），用平板振荡仪振荡10分钟，在酶联免疫检测仪测定A490 nm值，并计算细胞存活率(处理组A490 nm/ 对照组A490nm×100﹪)，实验重复3次，绘制剂量效应曲线，求出半数抑制剂量(IC50)。耐药指标采用逆转倍数和相对逆转率。
细胞周期的检测
以2×104/ml密度将对数生长期细胞HL-60细胞及HL-60/VCR(脱药2周后) 接种于6孔板，分别于48小时后收集细胞（ 细胞数约＞ 1×106），用预冷的PBS洗2次，离心去上清后，加入1 ml PBS和 2 ml无水乙醇固定过夜，加入DNA-Prepstain染液染色后，用ELITE ESP流式细胞仪（FCM Coulter 公司）检测各组细胞的荧光强度，每份样品检测约5 000细胞，用DNA Multi Cycle软件（Beckman Coulter）进行统计学分析，得到各个组细胞周期时相。
P170蛋白表达的Western blot检测
按分子克隆方法，分别提取HL-60细胞及HL-60/VCR细胞总蛋白，经紫外分光光度法定量后，各组取等量总蛋白进行8％SDS－PAGE电泳并转移到PVDF膜上，膜用封闭液（blocking buffer） (TBS+1% BSA+0.05% Tween 20) 封闭1小时，加入Pgp (1∶100稀释)单克隆抗体4℃过夜，次日37℃复温1小时，TBST洗膜，兔抗小鼠IgG-过氧化物酶二抗室温孵育1小时，TBS洗膜后DAB显色。
细胞内柔红霉素浓度的测定
实验分为2组:HL-60 细胞组和HL-60/VCR细胞组; 调整各组细胞浓度为 1 × 106 /ml，同时加入DNR至终浓度为10 mg /L，60分钟后加入等体积预冷的PBS以终止细胞代谢，用冷PBS洗涤2次，立即用流式细胞仪测定细胞内DNR被激发的相对荧光强度，激发波长为488 nm，发射波长为575 nm，以荧光任意单位的对数值表示DNR浓度。
HL-60／VCR及其亲本细胞株差异基因表达谱基因芯片技术的研究
用TrizoL试剂分别提取HL-60及HL-60/VCR细胞的总RNA，并检测其质量浓度及A260／280值。按照Affymetrix公司方法进行反转录、体外转录（同时进行生物素标记）合成cRNA探针、基因芯片杂交、洗脱、染色和检测。芯片扫描所得数据用Affymetrix Microarray Suite software 5.0进行计算和处理。
统计学分析
组间比较采用t检验。
结果
HL-60／VCR优势克隆的形成
细胞培养1周左右，96孔板孔中即形成较大克隆，待克隆长至孔中培养液体积的1／3后将细胞转种于24孔培养板扩大培养。细胞甩片并进行瑞氏-姬姆萨染色，可见筛选出的HL-60／VCR细胞体积明显大于HL-60细胞，胞形不规则，核仁更为明显（图1，2）。
HL-60／VCR体外药物敏感试验
HL-60/VCR细胞对多种化疗药物的IC50值明显大于HL-60细胞（耐药倍数为7-251.2）。逆转效率的高低与化疗药物种类有关，其中以DNR、TPT的耐药倍数较高（附表）。
细胞周期的检测
流式细胞仪检测显示，HL-60细胞主要聚集于S+G2期，而其耐VCR细胞主要聚集于G1期（图3、4）。
Western blot检测
Western blot 检测显示，HL-60/VCR细胞株高表达P170糖蛋白，而HL-60细胞株未见表达P170糖蛋白（图5）。
HL-60/VCR细胞内DNR的蓄积
HL-60细胞和HL-60/VCR细胞内DNR浓度差别很大，前者蓄积能力强，细胞内DNR平均荧光强度为12.1，后者蓄积能力低，细胞内DNR平均荧光强度为8.69（P<0.05)(图 6，7)。
基因芯片对HL-60／VCR及其亲本细胞株差异表达基因的生物信息学分析
利用基因芯片HU-133A对来自HL-60、HL-60/VCR细胞株进行检测的结果是：在总共22 283个探针池中，HL-60组检测到了10 707个，占总数的48.1％；HL-60/VCR组检测到了11 248个，占 50.5％。进一步运用Affymetrix 公司提供的分析软件Affymetrix Microarray Suite software 5.0对两个样品的芯片检测所得数据进行处理，结果发现：与HL-60细胞株比，HL-60/VCR细胞株检测到有3 058个基因表达上调，其中上调倍数大于2倍的有435个；表达下调的基因共有696个，其中有605个基因的下调倍数大于2，它们分别是与细胞分化、凋亡等生长活动相关的调节因子及信号转导相关基因。基因表达谱的散点图见图8。图中的每一个点代表1个基因，X轴和Y轴分别代表基因在HL-60细胞中和在HL-60/VCR细胞中表达的信号强度。没有差异表达的基因分布在以管家基因均衡后的斜线周围，远离斜线的为差异表达（上调或下调）的基因及阳性对照。
在上述的差异表达基因中，芯片ID号为39729-at（GenBank号为L19185）的基因NKEFB，在HL-60/VCR细胞株中表达水平除mdr1外其上调最为显著（与HL-60细胞株相比上调了335倍）。
白血病的多药耐药是一种复杂的多基因相关现象［1-3］，有关其分子机制仍然不是很清楚。针对多药耐药相关基因如mdr1所采取的逆转耐药措施目前经临床证实仍不能有效解决耐药问题。寻找新的耐药相关基因，揭示耐药机理，进而新的逆转耐药方法，这无疑是非常必要的。本实验诱导并维持HL-60/VCR细胞系的耐药性，MTT法测定其耐药倍数，Western blot法鉴定P170分子的存在，流式细胞仪鉴定P170分子泵的功能，比较白血病细胞HL-60和长春新碱耐药细胞HL-60／VCR二者在细胞周期上的差异，明确耐药细胞株的耐药特性。由于传统筛选差异功能基因的方法如消减杂交、差示PCR等具有筛选基因有限、假阳性率高等缺点，所以我们选择了Affymetrix 公司提供的人类全基因组芯片U133A，高通量、平行分析了髓系白血病细胞株HL-60及其耐药细胞株HL-60/VCR，并通过比对以寻找新的耐药相关基因。我们发现，在耐药细胞株中明显上调的基因有435条，明显下调的基因有605条，其中NKEFB基因上调尤为明显，幅度仅次于mdr1基因。有研究表明，此基因编码一组抗氧化酶，可抵抗过氧化氢及烷基过氧化氢的氧化作用；所编码蛋白具有保护细胞抗氧化的作用，也可有助于CD8+ T细胞的抗病毒作用；此蛋白还有助于肿瘤的增殖及发展［11］。关于此基因究竟是否参与了血液病细胞多药耐药的形成，其他所筛选差异基因与多药耐药机制的相关程度的相关研究正在进行中。
【】
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