人急性单核细胞白血病细胞系SHI?1在裸鼠体内的高致瘤性及其机制的初步研究

          作者：陈苏宁，薛永权，潘金兰，吴亚芳，王勇，岑建农

【摘要】  本研究确定人急性单核细胞白血病细胞系SHI?1在裸鼠体内的高致瘤性，并对其成瘤机制进行初步探讨。将SHI?1细胞接种至裸鼠皮下，观察肿瘤生长情况；取肿瘤组织行病理检测、R显带核型分析；RT?PCR检测MLL?AF6融合基因和VEGF基因的转录；明胶酶谱法检测培养上清中基质金属蛋白酶?9（MMP?9）和MMP?2的表达；体外穿膜实验观察迁移能力。结果表明： 注射SHI?1细胞的16只裸小鼠均于皮下出现肿块；瘤体由白血病细胞组成；注射的裸鼠中有MLL/AF6融合基因和VEGF基因的转录；在无血清培养上清中MMP?9和MMP?2的表达明显高于对照细胞；SHI?1细胞有较强的迁移能力，MMP?2的阻断抗体可显著抑制其体外迁移能力。结论：SHI?1在裸鼠体内有极高的成瘤率，其机制可能与p53基因的异常、高水平VEGF基因的转录、金属蛋白酶的高表达和较强的体内浸润能力有关。

【关键词】  急性单核细胞白血病

    High Tumorigenicity  of  Human Acute Monocytic Leukemic Cell Line SHI?1 in Nude Mice and  Its Mechanism

      Abstract    This study was purposed to explore the  tumorigenicity of a novel human monocytic leukemic cell line SHI?1 in nude mice and its mechinism.  The tumorigenicity in mice was evaluated in sixteen nude mice subcutaneously  injected with the SHI?1 cell line. The tumor specimen was studied by the conventional pathologic examination. The mononuclear cells (MNC) of the tumor was assayed by RHG banding,    the transcription of  MLL?AF6 fusion gene and the VEGF gene was detected by RT?PCR. Gelatin zymography method was used to study the expression of MMP?9 and MMP?2 in the supernatant of the SHI?1 cell line. Matrigel invasion assay was employed for the study of migration of the SHI?1 cell in vitro.  The results  showed that the tumor masses were found in all sixteen mude  mice after subcutaneous injection of SHI?1 cells,  the tumor mass was mainly composed of leukemia cells,  the transcription of MLL?AF6 fusion gene and VEGF gene  was proved by RT?PCR analysis,  the expressions  of MMP?2 and MMP?9 in the serum?free culture supernatant of the SHI?1 cell line were   significantly  higher than those in U937, K562, and NB4 cell lines. The SHI?1 cell line exhibited significantly higher in vitro invasiveness than other leukemia cell lines,  the blocking antibody of MMP?2 could inhibit the migration of the SHI?1 cell line significantly. It is concluded that the  SHI?1 cell line presents higher tumorigenicity in nude mice than other leukemia cell line and the mechanism is associated with p53 gene alteration, high transcription level of VEGF gene, high expression level of  MMP, and  significantly higher invasiveness.

    Key words    acute monocytic leukemia; SHI?1 cell line; t(6;11)(q27;q23); tumorigenicity; p53 gene

    由于动物模型相对于体外实验而言更接近于人体内的真实情况，建立疾病的动物模型对于深入研究疾病的发生机制和方法有着极其重要的意义。白血病的研究同样也离不开白血病的动物模型。然而大多数白血病细胞系在裸鼠体内的致瘤率非常低，如K562细胞系经体内筛选后所得的亚克隆K562/n才具有较高的致瘤率［1］，HL?60和其它常用白血病细胞系的致瘤率也较低。近年本实验室建立了国内第1个以t(6;11)(q27;q23)和p53基因异常为特征的人单核细胞白血病细胞系［2］， 命名为SHI?1。我们对SHI?1细胞系的致瘤特性及其机制进行了研究。

    实验血液学杂志  J Exp Hematol 2007; 15(4)人单核细胞白血病细胞系SHI?1在裸鼠体内的高致瘤性及其机制的初步研究材料和方法

    裸鼠饲养

    取4周龄NC裸鼠4只和BALB/c裸鼠12只，饲育于NASA1000级净化室内，饲料、饮水和笼具等均灭菌后使用，工作人员按无菌规则操作。

    SHI?1细胞的接种

    白血病细胞系SHI?1由本所建立，收集对数生长期SHI?1细胞，调整细胞浓度为2×108/ml，给每只裸鼠于右侧背部皮下注射100 μl，每日观察注射部位肿瘤生长情况。

    肿瘤组织的病理检测

    分离裸鼠实体肿瘤组织，常规固定，石蜡包埋、切片，HE染色。光学显微镜下观察、采集图像。

    肿瘤组织中单个核细胞（MNC）的分离

    无菌条件下分离裸鼠实体肿瘤组织，眼科剪剪碎，碾磨后经100目和200目滤网过滤，将所得细胞悬液收集至无菌离心管，加入适量RPMI 1640培养液，  378×g离心5分钟，弃上清，再加入适量RPMI 1640培养液，吹打、混匀后378×g离心5分钟，弃上清，调整浓度，备用。

    核型分析

    将由裸鼠肿瘤组织中分离的MNC以1×106/ml的浓度接种于含15％胎牛血清的IMDM培养液中，加入秋水仙酰胺，使终浓度为0.05 μg/ml，置37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱培养1小时后收获，染色体标本制备和R显带按本室常规方法［3］。核型分析根据《国际人类细胞遗传学命名体制（ISCN）1995》。

    MLL?AF6融合基因的RT?PCR检测

    引物序列和PCR反应条件参照［4］。PCR产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳，扫描并分析结果。用于扩增VEGF基因的引物序列分别为: 5′?GGG CCTCCGAAACCATGAACTT?3′和5′?CGCATCAG GGGCACACAG ?3′；扩增产物为259 bp。反应体积为50 ml，其中包括: PCR缓冲液，MgCl2 1.5-2.0 mmol/L, dNTPs 0.2 mmol/L, 引物各12.5 pmol, Taq聚合酶1.5 U，逆转录产物4 m·综述·

    Mer功能研究进展

    范磊，阮长耿

    苏州大学附属第一江苏血液研究所，　苏州　215006

    摘要    Mer是Axl受体酪氨酸激酶家族中的一员，其受体Gas6和Mer结合后可以激活Mer的酪氨酸激酶活性，并激活下游信号传导途径，在细胞炎症、凋亡、血液肿瘤发生以及血栓于止血等方面发挥作用。本文主要就近年来Mer的功能研究进展以及Mer的抗血栓和抗血液肿瘤潜在治疗前景进行综述。

    关键词    Mer；受体酪氨酸激酶；Gas6；血栓；异位表达

     Advance of Study on Mer Function——Review

    FAN Lei, RUAN Chang?Geng

    Jiangsu Institute of Hematology, The First Affiliated Hospital of Suzhou University, Suzhou  215006, China

    Abstract     Mer is one member of Axl receptor tyrosine kinase family, and its ligand Gas6 can stimulate activity of Mer receptor tyrosine kinase after binding it, and then activate the downstream signal transduction pathway, Mer participates in cell inflammation, apoptosis, tumorigenesis, thrombosis and hemostasis. Rencet  advances of study  on Mer function were reviewed, and  its potential prospects of antithrombosis and antitumor were discussed in this article.

    Key words    Mer; receptor tyrosine kinase; Gas6; thrombosis; ectopic expression

    J Exp Hematol 2007; 15(4):892-895

    Mer（c?Mer Nyk Eyk）属于受体酪氨酸家族。此家族还包括Axl和Tyro3两个受体酪氨酸激酶，它们有着共同的配体—Gas6［1］。人类的Mer基因是1994年由Graham［2］首先从人类B淋巴母细胞λgt?11的cDNA文库中克隆得到，随后小鼠的Mer基因于1995年同样由 Graham成功克隆，并发现和人类的Mer基因具有88％的同源性［3］。Mer基因的命名主要是基于开始发现其在人单核细胞（monocytes）、上皮组织（epithelial tissue）和生殖系统组织（reproductive tissue）中表达较高。

    Mer的生物学性状及其配体

    Mer是Axl受体酪氨酸激酶家族的中一员，定位于2q14.1，基因全长为130 755 bp，包括19个外显子。Mer的mRNA共有3 632个 bp，一共编码由999个氨基酸组成的18-20 kD的蛋白［1］。Mer的基因结构和其家族其他两个成员类似，胞外区包括两个IgG样区，两个纤维连接蛋白样区，其中IgG样区为Mer和其配体Gas6结合区域，而纤维连接蛋白样区也在和生长阻滞特异基因6（growth arrest?specific gene 6,Gas6)结合过程中起调节作用［4］。胞内区为酪氨酸激酶样区，具有激酶的活性，并且具有该家族特有的KWIAIES序列。

    Mer的配体Gas6是1993年由Manfioletti首先克隆，并发现其氨基酸序列和蛋白S具有44％的同源性［5］。Gas6是1个VitK依赖、由678个氨基酸组成的75 kD的分泌型蛋白，其结构由Gla区、4个EGF样区和2个LaminG样区组成，其中LaminG样区为与其受体结合区域，而Gla和EGF样区也认为参与调节Gas6及其受体的结合过程［6］。

    Mer作为受体酪氨酸家族一员广泛表达于多种组织器官和体细胞，在外周血细胞中Mer主要表达于正常的单核细胞和血小板膜上，而不表达于正常的T、B淋巴细胞和粒细胞；组织器官中Mer在睾丸、卵巢、前列腺、肺和肾脏组织是高表达的，而在脾脏、胎盘、胸腺，小肠、大肠和肝脏表达较低，而在心脏、脑组织和骨骼肌则没有表达［1］。Graham等［1］和Dirks等［7］分别发现在多种恶性血液细胞株中Mer以及Gas6的异常表达升高，提示Mer可能参与恶性血液病的发生发展过程。

    细胞炎症和凋亡是体内两个重要的生理病理过程。近年来有多篇文章报道Mer与此有关。1999年Todd等［8］将LPS注入Mer-/-小鼠体内，结果发现Mer-/-小鼠有88.2％死于LPS引起的内毒素血症，而对照组只有6.7％的小鼠死亡，同时该小组检测到Mer-/-小鼠体内巨噬细胞分泌的TNF?α量明显高于对照组，并且利用TNF?α的单克隆抗体可以明显抑制LPS导致的内毒素性休克，提示Mer通过调节巨噬细胞分泌的TNF?α来参与LPS导致的内毒素性休克。同时我们也发现在利用LPS、TNF?α和IL?1β刺激后，人皮肤微血管内皮细胞无论在mRNA水平还是蛋白水平，Mer的表达量都是明显上升的，这一结果也可以从一个侧面证明Mer参与了细胞的炎症反应。

   Mer功能研究进展对于凋亡方面的作用，Mer和Axl家族其他成员作用有一定的差别。2002年Guttridge等［9］将构建的EGFR/Mer嵌合蛋白质粒转染到IL?3依赖的32D细胞株，并表达此嵌合蛋白，通过利用EGF刺激此嵌合蛋白可以发现Mer导致细胞骨架的结构改变并且抵抗由于IL?3撤离导致的凋亡，但并不刺激细胞的增殖，这和其他成员的作用是不同的。然而，将构建的Fms/Mer转染到NIT3T3细胞中则发现Mer具有细胞增殖作用的［10］。同时也应该注意到真正的全长Mer蛋白和EGFR/Mer嵌合蛋白是存在差别的。研究发现，EGFR/Axl可以抵抗32D细胞的凋亡同时刺激细胞增殖，但是利用Gas6刺激转染全长Axl的细胞时此作用并不明显，因此利用全长Mer蛋白进行功能研究也是必需的［11］。

    2001年首次发现Gas6和血小板功能相关，利用Gas6敲除（knockout）小鼠发现，被敲除Gas6基因的小鼠可以幸免于尾静脉注射胶原和肾上腺素导致的致死性血栓［12］。2004年Chen等［13］利用Mer敲除小鼠对Mer参与血小板功能做了较为全面的评价，他们应用RT?PCR和Western blot证明Mer表达于人和小鼠的血小板膜上，而同家族的Axl和Sky则没有此作用，Mer-/-小鼠的PRP对于低浓度聚集诱导剂诱导的血小板聚集反应较弱，而且敲除Mer基因后同样可以保护小鼠不死于尾静脉注射胶原和肾上腺素导致的肺栓塞。而与此同时Mer-/-小鼠的血小板和野生型小鼠一样可以结合正常数量的可溶性纤维蛋白原，没有自发性出血，并且各种凝血指标以及外周血细胞参数等没有显著的变化。2005年Goul等［14］利用流式细胞术发现Mer、Axl和Sky均表达于人的血小板上，这和Chen等的结论是矛盾的。利用针对拮抗Mer和Sky的单克隆抗体可以有效地抑制体外ADP、PAR?1和SFLLRN诱导的血小板聚集达80％之多，而抗Axl的抗体反而促进血小板聚集。由此看来，Gas6/Mer很可能在血栓形成过程中起到信号放大的作用，因为Gas6/Mer本身并不能引起血小板聚集而只是放大聚集诱导剂的作用。目前关于Mer及其家族成员和配体参与血小板黏附和释放功能的研究尚少，并且对于Mer在血栓中的作用研究也只局限于表象，对其内在的机理和相关的信号通路目前也只推测可能通过αⅡbβⅢa参与了血小板活化过程中“自外而内”的信号通路，但并没有相关的深入报道。

    Mer在正常的T、B淋巴细胞和粒细胞是不表达的，但是在某些恶性血液病细胞株，如Jurkat、PEER、K562和Raji中有Mer的异常表达［1］，这个现象提示Mer很可能和某些恶性血液疾病有关。

    2002年Hogerkorp等［15］利用高通量基因芯片技术发现Mer在外套细胞淋巴瘤中异常表达，并提示可能和此类疾病发生有关。2006年Graham等［16］利用流式细胞术和Western blot技术检测了16例儿童急性T淋巴细胞白血病患者，发现其中8例患者骨髓中异常表达Mer，并且高表达组患者白血病细胞表型多为CD3-，CD4-和CD8-，提示表型为幼稚型，而低表达组则多为CD4和CD8单阳性组，较为成熟。2006年Keating等［17］利用转基因技术将Mer异常表达于小鼠的淋巴细胞和胸腺组织，结果发现Mer转基因小鼠脾脏明显增大，并且在12月龄出现体重下降、活动减少和肝脾肿大等症状，24月龄经流式细胞仪检测有55％的Mer转基因小鼠证实罹患淋巴细胞白血病或者淋巴瘤，而野生型组这个比例只有12％。同时体外地塞米松诱导凋亡实验也证实转染Mer的淋巴细胞较野生型的淋巴细胞具有生长优势，提示Mer的抗凋亡效应可能起到作用并促进某些恶性血液病细胞的生长和防止药物诱导的凋亡。

    对于实体肿瘤中Mer的表达情况的报道较少，目前研究也主要局限于在某些恶性细胞株中的表达情况。1994年Graham等［2］利用RT?PCR的方法证实了Mer在肺癌细胞株A549、上皮瘤细胞株A431中表达较高，而在部分乳腺癌、胶质瘤和膀胱癌细胞株中有低水平表达。2004年Wu等［18］以转染了FMS/Mer嵌合蛋白的前列腺癌细胞株为模型，利用微阵列技术发现特异性的激活Mer活性可以使部分趋化因子表达上调，其中以IL?8的上调最为明显，而后者被认为与多种肿瘤发生、转移和血管新生有关。

    Mer作用的信号传导通路

    目前关于Mer具体的分子信号传导途径的研究还不十分完善。PLC?γ,PI3K,Src,Grb2,Raf?1以及ERK等下游分子的磷酸化作用可能与Mer的信号传导有关。位于激活Mer分子酪氨酸激酶区域的的Y749，Y753和Y754氨基酸被认为是Mer自动磷酸化的位点，并且Mer分子的完全活化需要三者共同的磷酸化作用［19］。Y749，Y753和Y754三种位点同样存在于同家族的Axl和Sky分子中，提示这可能是该酪氨酸激酶家族激活的重要保守区域。Todt等［20］利用单克隆抗体技术证明，Mer可以激活下游的PLC?γ分子，并且与巨噬细胞吞噬凋亡胸腺细胞的过程有关。小鼠Mer酪氨酸激酶区域的嵌合蛋白可以持续激活下游的ERK分子并导致Ba/F3前B淋巴白血病细胞的增殖；实验显示，小鼠Mer的Y867位氨基酸（相当于人类Mer分子的Y872位）可以结合Grb2分子，从而依次激活下游的PI3K以及NF?κB分子，而PI3K/NF?κB信号途径被认为是与很多细胞的凋亡和分化等重要生理过程有关［21］。另外有报道证实，人类Mer分子的Y872位氨基酸是多个下游分子的结合位点，其中可能包括PLC?γ,PI3K,c?Src,Grb2和Lck［22］。Besser等［23］利用点突变技术证明，Mer介导的细胞转化作用是通过激活下游的STAT分子信号途径实现的。虽然有报道Mer氨基酸第933位的L?Q突变会明显激活下游的STAT3分子并增加Mer的细胞转化效率，但是还是认为人类的Mer分子主要激活的下游的STAT1分子。除了PI3K/NF?κB分子信号途径，Mer也可以通过其他信号通路起作用，利用基因芯片技术筛选的Mer可以强烈地诱导IL?8生成，并导致细胞分化，同时也证实Mer介导的IL?8上调是通过ERK分子信号途径而不是PI3K/NF?κB途径实现的。

    针对Gas6/Mer途径的抗血小板药物临床应用前景Mer或者Gas6基因敲除小鼠都显示血小板聚集和血栓形成能力下降，同时没有自发性出血、各种凝血指标和外周血细胞参数正常等现象，因此有人推测Gas6/Mer信号途径可能在血小板聚集中起到信号放大和加速的作用，而其本身并不引起血小板聚集。体外实验也表明，针对Mer的单克隆抗体可以抑制多种低浓度诱导剂引发的血小板聚集。目前传统的抗血小板药物多为抑制血小板“自内而外”的信号传导，比如阿司匹林可以抑制环氧化酶进而抑制血栓恶烷A2的合成；氯吡格雷则通过拮抗P2Y12受体发挥作用。目前抗血小板药物在抑制血小板聚集的同时存在较大的出血风险，因此针对Gas6/Mer等调节途径的新一代抗血小板药物有望成为的新靶点，此类药物的特点就是可逆性抑制血小板聚集而没有明显的出血等副作用，这点已经在基因敲除的小鼠模型中得到证实。

    Mer在8例儿童急性T淋巴细胞白血病中的异常表达表明，Mer的抗凋亡作用可能参与某些恶性血液病的发生发展并抵抗药物诱导的凋亡。目前已有多种酪氨酸激酶被报道参与白血病的发生，如由于染色体异位产生的ABL基因就是典型代表，其他还有ARG、FLT3、C?FMS、JAK2和C?KIT等。目前针对ABL和FLT?3的特异性抑制剂已经应用于临床并成为白血病靶向治疗的典范，而Mer在急性T淋巴细胞白血病中的异位表达也提示其可能成为治疗恶性血液病的新药物。

    结束语

    Mer作为一种新型的酪氨酸激酶在1994年被首次克隆后其功能被日益完善，多篇研究报道其参与炎症、凋亡、血栓、止血等多种生理过程，并且Mer在急性T淋巴白血病细胞以及部分恶性肿瘤白血病细胞株中的异常表达也提示其可能在肿瘤发生发展等重要病理过程中扮演重要的角色，因此针对Gas6/Mer信号转导途径的特异性靶向治疗，可能成为研制相关疾病新一代的药物的线索。

【】
  1Mark MR, Chen J, Hammonds RG, et al. Characterization of Gas6, a member of the superfamily of G domain?containing proteins, as a ligand for Rse and Axl. J Biol Chem， 1996； 271: 9785-9789

2 Graham DK, Dawson TL, Mullaney DL， et al. Cloning and mRNA expression analysis of a novel human protooncogene, c?mer. Cell Growth Differ， 1994；5: 647-657

3Graham DK, Bowman GW, Dawson TL， et al. Cloning and developmental expression analysis of the murine c?mer tyrosine kinase. Oncogene， 1995； 10: 2349-2359

4Nakano T, Kishino J, Arita H. Characterization of a high?affinity and specific binding site for Gas6. FEBS Lett， 1996； 387:75-77

5Manfioletti G, Brancolini C, Avanzi G， et al. The protein encoded by a growth arrest?specific gene (gas6) is a new member of the vitamin K?dependent proteins related to protein S, a negative coregulator in the blood coagulation cascade. Mol Cell Biol， 1993； 13: 4976-4985

6Nagata K, Ohashi K, Nakano T， et al. Identification of the pro? duct of growth arrest?specific gene 6 as a common ligand for Axl, Sky, and Mer receptor tyrosine kinases. J Biol Chem， 1996； 271: 30022-30027

7Dirks W, Rome D, Ringel F， et al. Expression of the growth arrest?specific gene 6 (GAS6) in leukemia and lymphoma cell lines. Leuk Res， 1999；23：643-651

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9Guttridge KL, Luft JC, Dawson TL， et al. Mer receptor tyrosine kinase signaling prevention of apoptosis and alteration of cytoskeletal architecture without stimulation or proliferation. J Biol Chem， 2002； 277: 24057-24066

10Ling L, Kung HJ. Mitogenic signals and transforming potential of Nyk, a newly identified neural cell adhesion molecule?related receptor tyrosine kinase. Mol Cell Biol， 1995;15:6582-6592

11Liu E, Hjelle B, Bishop JM. Transforming genes in chronic myelogenous leukemia. Proc Natl Acad Sci USA， 1988;85:1952-1956

12Angelillo?Scherrer A, de?Frutos P, Aparicio C， et al. Deficiency or inhibition of Gas6 causes platelet dysfunction and protects mice against thrombosis. Nat Med, 2001；7:215-221

13Chen C, Li Q, Darrow AL， et al. Mer receptor tyrosine kinase signaling participates in platelet function. Arterioscler Thromb Vasc Biol， 2004； 24:1118-1123

14Gould WR, Baxi SM, Schroeder R, et al. Gas6 receptors Axl, Sky and Mer enhance platelet activation and regulate thrombotic responses. J Thromb Haemost， 2005; 3: 733-741

15Ek S, Hogerkorp CM, Dictor M, et al. Mantle cell lymphomas express a distinct genetic signature affecting lymphocyte trafficking and growth regulation as compared with subpopulations of normal human B cells. Cancer Res， 2002; 62: 4398-4405

16Graham DK, Salzberg DB, Kurtzberg J, et al. Ectopic expression of the proto?oncogene Mer in pediatric T?cell acute lymphoblastic leukemia. Clin Cancer Res， 2006;12:2662-2669

17Keating AK, Salzberg DB, Sather S， et al, Lymphoblastic leukemia/lymphoma in mice overexpressing the Mer(MerTK) receptor tyrosine kinase. Oncogene， 2006; 25: 6092-6100

18Wu YM, Robinson DR, Kung HJ， et al. Signal pathways in up?regulation of chemokines by tyrosine kinase MER/NYK in prostate cancer cells. Cancer Res， 2004;64:7311-7320

19Ling L, Templeton D, Kung HJ. Identification of the major autophosphorylation sites of Nyk/Mer, an NCAM?related receptor tyrosine kinase. J Biol Chem， 1996;271:18355-18362

20Todt JC, Hu B, Curtis JL. The receptor tyrosine kinase MerTK activates phospholipase C gamma 2 during recognition of apoptotic thymocytes by murine macrophages. J Leukoc Biol， 2004;75:705-713

21Georgescu MM, Kirsch KH, Shishido T, et al. Biological effects of c?Mer receptor tyrosine kinase in hematopoietic cells depend on the Grb2 binding site in the receptor and activation of NF?kB. Mol Cell Biol， 1999;19:1171-1181

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