实时定量RT?PCR检测急性早幼粒细胞白血病PML?RARa融合基因
作者：段连宁 郎丽 李惠民 刘华 王义民 张学美
【摘要】 本研究旨在建立用实时定量RT?PCR检测急性早幼粒细胞白血病（APL）PML?RARa mRNA的方法，探讨APL PML?RARa融合基因表达水平与疗效的关系。用RT?PCR扩增培养的NB4细胞的PML?RARa融合基因，取1μg NB4细胞的总cDNA进行10倍的梯度稀释，作为标准品，建立荧光定量RT?PCR方法，对方法的灵敏性、稳定性、重复性进行了测定。定量检测4例急性早幼粒细胞白血病（APL）患者前后骨髓内PML?RARa融合基因转录本水平，并对1例经治疗完全缓解后又复发的患者PML?RARa转录本水平（拷贝数）进行动态监测。结果表明：用本研究 建立的实时定量RT?PCR方法可检测出10-5 μg NB4细胞cDNA中的PML?RARa融合基因，其重复性的CT值，管间、批间变异系数（CV）分别为2.1%、3.8%。4例患者初治骨髓PML?RARa基因转录本水平的分别为1 884、5 533、1 803、4 677拷贝，平均为3 475拷贝。经ATRA+化疗治疗后其PML?RARa基因转录水平下降至40、135、79、229拷贝，平均为121拷贝。还有1例患者治疗前PML?RARa基因转录本水平为8 600拷贝，经过4个月治疗，虽然此时患者处于完全缓解期，但其转录水平拷贝数仍有730。3个月后患者出现复发，转录本水平升至为11 000拷贝。经过ATRA+化疗治疗后转录本水平又逐渐下降至1 200拷贝。结论；建立的实时定量RT?PCR灵敏、重复性好。治疗后APL患者的PML?RARa融合基因转录本水平明显下降，复发时基因转录本水平又升高。融合基因表达水平的改变与临床疾病进展关系一致，这有助于监测白血病微小残留病，评价疗效及判断预后。
【关键词】 急性早幼粒细胞白血病
Detection of PML/RARa Transcripts in Acute Promyelocytic Leukemia by Real?time Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction
Abstract Tihs study was purposed to establish a real?time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT?PCR) for detection of PML/RARa fusion gene in patients with acute promyelocytic leukemia (APL) and to explore the relationship between the expression level of PML/RARa fusion gene transcript and the clinical status or efficacy of the therapy in APL. The conventional RT?PCR was used to amplify PML/RARa gene from cultured NB4 cells. Standard curves were constructed by modified real?time PCR on standard template after 10?fold serial dilutions of cDNA of 1 μg NB4 cells. The sensitivity, stability and repeatability of this method was determined. The PML/RARa gene transcripts of bone marrows in 4 APL patients before and after treatment and in 1 APL patient relapsed after complete remission were dynamically detected by modified real?time quantitative RT?PCR. The results indicated that the sensitivity of real?time quantitative RT?PCR for detecting PML/RARa fusion gene was about 10-5 μg cDNA from NB4 cells, the repeatability and reproducibility of this method were satisfactory, intra?and inter?assay coefficients of variation were 2.1% and 3.8%. The copy numbers of PML/RARa transcripte reflecting PML/RARa fusion gene expression level in 4 newly diagnosed patients with APL were 1884, 5533,1803, 4677 and the median was 3 475. After ATRA+chemotherapy copy numbers of PML/RARa transcript decreased to 40, 135, 79, 29, and mean was 121. Another patient′s PML/RARa gene copy number was 8600 at diagnosis, the gene copy number was 730 after therapy for 4 months, although he was in complete remission, but copy number increased to 11 000 when APL relapsed 3 months later.The copy number efficiently reduced to 1200 after ATRA+chemotherapy.It is concluded that the established real?time quantitative RT?PCR method is sensitive, reliable, accurate and repeatable. The efficiency of method was finally tested for patient samples, showing a PML/RARa transcript copy number in APL patients significantly decrease after therapy, and increase at the time of relapse which indicate that changes of fusion gene expression levels coincide with clinical progress of disease. This method can be used to detect the minimal residual disease, assess response to treatment and evaluate prognosis of disease.
Key words real?time quantitative RT?PCR; acute promyelocytic leukemia; PML?RARa fusion gene; minimal residual disease
实时定量RT?PCR检测急性早幼粒细胞白血病PML?RARa融合基因 急性早幼粒细胞白血病（APL）具有特异性的染色体易位t（15;17）易位，使17号染色体上的RARa基因与15号染色体上PML基因融合，产生融合基因PML?RARa。 实时定量逆转录?聚合酶链反应（RT?PCR）技术实现了从定性到定量的飞跃，自动化程度高，因而其应用也越来越广泛。我们应用这一方法检测PML?RARa融合基因作为APL临床诊断、评估微小残留病（MRD）和判断其预后的手段。
材料和方法
主要仪器
PE9600型定性PCR扩增仪（美国Perkin?Elmer公司产品），PowerPac3000型电泳仪，Gel Doc1000紫外图像分析系统和配套分析软件（Bio?Rad公司产品），Gene Amp5700 Sequence Detecor定量PCR扩增仪及配套分析系统和配套分析软件（美国Bio?Rad公司产品）；5700型定量PCR仪（美国ABI公司产品）；5417R高速冷冻离心机和5415C高速离心机（德国Eppendorf公司产品）。
主要试剂
RPIM 1640（Gibco公司产品）；胎牛血清（杭州四季青生物工程有限公司产品）；淋巴细胞分离液（协和医科大学生物研究所产品）；TRIzoL试剂（美国MRC公司产品）；逆转录试剂盒（Fermentas公司产品）；PML?RARa基因、β?肌动蛋白(β?actin)寡核苷酸引物（上海生工生物工程公司产品）；DEPC水（焦碳酸二乙酯）(Bio Basic Inc产品)；LoadingBuffer, DNA Marker DL2000,Taq DNA聚合酶, dNTP(大连宝生物工程有限公司产品)；Sybr GreenⅠ染料(美国Bio?Rad公司产品)。
检测标本
细胞系 NB4细胞（引自上海瑞金血液研究所）常规培养。
骨髓标本 取自5例APL患者的骨髓（男3例，女2例，14岁-42岁，平均年龄30岁）。
单个核细胞的分离及总RNA提取
取患者EDTA抗凝骨髓2 ml，用淋巴细胞分离液分离获得单个核细胞，然后对单个核细胞和培养的5×106个NB4细胞，分别采用TRIzoL试剂并按试剂操作说明书提取总RNA，经紫外分光光度计测定浓度后，-80℃保存备用。
引物的设计和合成
PML?RARa融合基因形成过程中，RARa上的断裂点总是位于第2个内含子内，但是PML上的断裂点存在很多变异，主要集中在3个断裂点丛集区（bcr）。bcr1在第6个内含子内，形成长型转录本（L）。断裂点bcr3在PML第3个内含子内，产生短型转录本（S）；而bcr2断裂点位于第6外显子内形成变异型转录本（V）。这3种转录本分别占70％（L），20％（S）和10％（V）。我们检测了L型融合基因拷贝数。L型引物序列参照了国外［1］，应用β－actin作为内对照，具体序列如下表：
L型 上游引物P6 ：5′ ?GTCTTCCTGCCCAACAGC AACC?3′ (190 bp)；下游引物R1：5′ ?CTCACAGGC GCTGACCCCATAGT?3′。β?actin 上游引物： 5′ ?AACGGC TCCGGCATGTGCAA?3′ (117 bp)，下游引物： 5′ ?CTTCTGACCCATGCCCACCA?3′
cDNA合成
取1 μg总RNA，采用cDNA合成试剂盒进行逆转录反应，20 μl体系的组成如下：随机引物（oligodT 0.5 μg/μl）1 μl, 5×buffer 4 μl, RNA酶抑制剂（20 U/μl） 1 μl, 10 mmol/L dNTP Mix 2 μl, 逆转录酶（MMULV） 1 μl。反应条件37℃ 5分钟,42℃ 60分钟,70℃ 10分钟。cDNA合成后以cDNA为模板进行β?actin管家基因的PCR扩增(图1)，判断是否逆转录成功。Figure 1. Electrophoresis pattern of β?actin amplified by RT?PCR on agarose gel.
转录本类型的定性PCR确定
取上述cDNA 2 μl作为模板，以L型的正反向引物进行PCR反应。25 μl体系包括10×buffer 2.5 μl，MgCl2 (25 mmol/L)2.5 μl，dNTP (10 mmol/L)1 μl,Taq酶（5 U/μl）0.2 μl,正反相引物均为1 μl。反应条件：94℃ 5分钟，94℃ 45秒，60℃ 60秒，72℃ 90秒，共40个循环，72℃ 6分钟。
L型转录本的扩增长度190 bp。经琼脂糖凝胶电泳鉴定，如图2：退火温度为58℃时在250-500 bp之间有非特异性条带，60℃时非特异性条带较58℃时少，我们选择60℃为退火温度。
Figure 2. Electrophoresis pattern of PML?RARa amplified by RT?PCR on agarose gel.
L型PML?RARa基因标准品的构建
用紫外分光光度计测NB4细胞的cDNA的浓度后，取1 μg的cDNA依次进行10倍的梯度稀释，分装为1 μg，10-1 μg，10-2 μg，10-3 μg，10-4 μg，10-5 μg作为各自的标准品。（在NB4细胞中1 μg的cDNA包含104拷贝的PML?RARa基因［1］）（图3）。
Figure 3. Amplification curves of reference at 102 -104 initiation copy number.
定量PCR反应
定量PCR反应体系 25 μl体系中包括 10×Buffer 2.5 μl，MgCl2 (25 mmol/L)2.5 μl，dNTP(10 mmol/L)1 μl,Taq酶（5 U/μl）0.2 μl,正反相引物均为1 μl, cDNA或标准品2 μl，SYBER?GREEⅠ染料3 μl。
熔解曲线分析
先按94℃ 5分钟，94℃ 45秒，60℃ 60秒，72℃ 90秒， 40个循环，72℃ 6分钟的反应条件进行定量PCR反应。反应结束后，仪器自动进行了熔解曲线分析，如图4示：从熔解曲线图中可见到两个峰，一个峰值在69℃左右，另一个峰值在88℃左右。69℃左右的峰为引物二聚体小片段和染料结合释放荧光产生的。88℃左右的峰为目的片段和染料结合释放荧光产生的。我们为了消除小片段非特异产物的影响，在延伸后加了升温至87℃，持续5秒的步骤。则定量PCR反应条件为：94℃ 5分钟，94℃ 45秒，60℃ 60秒，72℃ 90秒，87℃ 5秒，共40个循环，72℃ 6分钟。
Figure 4. Analysis of melting curve. Derivative(?dF/Dt):negative value of ten to one time derivative of fluorescence strength changed with temperature. 制作标准曲线
将各个标准品的起始拷贝数取对数，作为横坐标，其所对应的Ct值(循环域值，cycle threshold )作为纵坐标，即可做出相应的标准曲线(图5、6)。将各个样本的平均Ct值，代入相应的标准曲线，就可求出PML?RARa基因和β?actin的拷贝数。校正的PML?RARa转录本水平(Dose N)=（PML?RARa的拷贝数／β?actin的拷贝数）×105［2］。
结 果
方法的灵敏度
对培养的 1 μg NB4细胞的cDNA，进行10倍梯度稀释，分别用建立的荧光定量RT?PCR作检测，可得到Ct值，其检测PML?RARa融合基因的灵敏度达10-5 μg cDNA（表1），由此制作出标准曲线的相关性，相关系数为0.997。
方法的稳定性和重复性
我们对104基因拷贝数的模板分别做5个反应管检测。比较同一次反应不同反应管间的批内变异及重复5次检测比较不同时间的反应结果的批间变异。检测到该浓度同一次反应不同反应管的Ct值分别为：21.8，21.5，20.8，21.4，22.0；不同时间检测的Ct值为：20.8，21.6，22.3，23.0，21.7。批内变异系数为2.1％，批间变异系数为3.8%。这说明本方法稳定性和重复性均好。
分析4例APL患者（经定性PCR电泳结果确定为L型）初治时骨髓PML?RARa基因转录本水平，其转录本水平（拷贝数）分别为1 884，5 533，1 803，4 677，平均拷贝数为3475（表2）。
以上4例APL患者经ATRA＋化疗6个月左右后，再次检测其PML?RARa基因转录水平（拷贝数），结果分别为40，135，79，229，平均拷贝数为121。具体数据如表2。4例患者治疗后基因拷贝数分别为治疗前的了1/47，1/41，1/23，1/21。
治疗前后患者PML?RARa转录本水平的比较
4 例患者治疗前转录本水平的平均数3 475（1 803-5 533）拷贝， 经ATRA＋化疗治疗 6 个月后再次检测转录本水平，其平均数为121（40-229）拷贝。治疗前和治疗后转录本水平经t检验得p=0.036(<0.05），说明治疗前和治疗后转录本水平之间差异有统计学意义，其具体数据见表3。4例患者治疗前转录水平的变异系数为55%,治疗后转录水平的变异系数为68%,治疗后变异系数大于治疗前，由此推测不同患者对化疗药的敏感程度差异比较大。
还有1例患者治疗前基因转录本水平为8 600拷贝，经过4个月治疗，虽然此时患者处于完全缓解期，但其转录水平拷贝数仍有730。3个月后患者出现复发，转录本水平升至为11 000拷贝。经过ATRA+化疗治疗后转录本水平又逐渐下降至1 200拷贝（图7）。
讨 论
实时定量RT?PCR（real?time quantitative reverse?transcription polymerase chain reaction, RT?PCR）是在普通PCR反应中加入能与PCR产物结合的荧光探针或荧光染料，使之荧光信号随着扩增产物的增加而成比例增长，仪器实时检测每一个循环结束后的荧光强度，通过与标准曲线对比得出定量结果。可以直接检测目的基因的起始数量，从而动态监测融合基因水平［3］。从扩增到产物分析都是闭管操作，最大限度避免了污染，无PCR后处理。SYBR green Ⅰ是一种能与双链DNA结合的荧光染料，游离时几乎没有荧光信号，本底很低。PCR进行过程中，它能结合到扩增产物双链DNA的小沟中，荧光强度大大增强。实验中产生的非特异性双链DNA（如引物二聚体）也会和染料结合产生荧光信号，其产生的干扰可通过熔解曲线分析得到解决。只要有合适的引物就可实现目的基因的RQ?PCR［4］。较之序列特异性荧光探针，它无需探针设计，大大简化了实验难度，且价格便宜，是一种值得推荐的荧光定量PCR技术。国外报道，用荧光定量PCR方法重复40次反应，其Ct值的变异系数为1.6%。如电泳凝胶扫描定量，其变异系数高达31%，两者相差19倍多［4］。本实验管间、批间变异系数分别为2.1%和3.8%，与其相近。说明本方法稳定性和重复性均好。我们使用定量RT?PCR方法检测PML?RARa融合基因的灵敏度达10-5 μg cDNA，按10-5 μg cDNA/细胞，本方法可从105个正常细胞中查出1个白血病细胞，与文献报道的定量RT?PCR方法相仿［5］。我们建立实时定量RT?PCR检测急性早幼粒细胞白血病融合基因，同时检测同一标本的融合基因及管家基因，不必考虑RNA提取及逆转录过程中的差异，以校正拷贝数（PML?RARa的拷贝数／β?actin的拷贝数）×105表示，使用管家基因β?actin对结果进行标化，更具性。
应用实时定量RT?PCR技术，不仅能够确定患者PML?RARa转录本的有无，而且可确定其转录本水平，观察其动态变化。通过实时定量RT?PCR监测PML?RARa转录本水平的变化，可以预测急性早幼粒细胞白血病患者的治疗反应，定量白血病细胞的残余数量和预测复发，这比细胞遗传学检查早数月［6,7］。我们检测了4例APL患者初治时骨髓PML?RARa基因转录本水平，其分别为1 884，5 533，1 803，4 677拷贝，平均拷贝数为3 475。经ATRA＋化疗治疗后基因转录水平分别为40，135，79，229拷贝，平均拷贝数为121。经治疗后PML－RARa基因转录本水平明显下降，证明治疗是有效的。治疗前和治疗后转录本水平经t检验得P=0.036<（0.05），这说明治疗前和治疗后转录本水平之间差异有统计学意义。4例患者治疗前时转录水平的变异系数为55%,治疗后转录水平的变异系数为68%。治疗后变异系数大于治疗前，由此我们可以推测，不同患者对化疗药的敏感程度差异比较大。还有1例患者治疗前PML?RARa基因转录本水平为8 600拷贝，经过2个月诱导巩固治疗，虽然此时患者处于完全缓解期，但其转录水平拷贝数仍有730。5个月后患者复发，转录本水平升至11 000拷贝数。经过ATRA+化疗治疗后转录本水平又逐渐下降至1 200。
总之，实时定量RT?PCR是一种快速、准确和高度敏感的实验方法，它不仅能够检测到微小残留病灶的存在，更重要的是，通过动态监测PML?RARa转录本水平及其变化，可以预测急性早幼粒细胞白血病患者的治疗反应，定量白血病细胞的残余数量和预测复发，这比定性PCR检测具有更为重要的临床意义。
【文献】
1Cassinat B, Zassadowski F, Balitrand N, et al. Quantitation of minimal residual disease in acute promyelocytic leukemia patients with t(15;17) translocation using real?time RT?PCR. Leukemia, 2000; 14:324-328
2Gu BW，Hu J，Xu L，et al．Feasibility and clinical significance of real?time quantitative RT?PCR assay of PML?RARa fusion transcript in patients with acute promyeloeytic leukemia．Hematol J，2001;2:330-340
3Diverio D, Rossi V, Avvisati G, et al. Early detection of relapse by prospective reverse transcription?polymerase chain reaction analysis of the PML/RAR alpha fusion gene in patients with acute promyelocytic leukemia enrolled in the GIMEMA?AIEOP multicenter “AIDA” trial. Blood, 1998; 92:784-789
4van?der?Velden VHJ, Hochhaus A, Cazzaniga G, et al. Detection of minimal residual disease in hematologic malignancies by real?time quantitative PCR: principles, approaches, amd laboratory aspects. Leukemia, 2003;17:1013-1034
5Slack JL, Bi W, Livak KJ, et al. Pre?clinical validation of a novel, highly sensitive assay to detect PML?RARa mRNA using real?time reverse?transcription polymerase chain reaction. J Mol Diagn, 2001; 3:141-149
6Merx K, Muller MC, Kreil S, et al．Early reduction of BCR?ABL mRNA transcript levels predicts cylogenetic response in chronic phase CML patients ated with imatinib after failure of interferon alpha．Leukemia, 2002;16:1579-1583
7Cross NC． Minimal residual disease in chronic myeloid leukaemia．Hematol Cell Ther,1998; 40:224-228?
