定量检测bcr?abl mRNA在慢性粒细胞白血病患者异基因造血干细胞移植后的意义
作者：耿素霞，杜欣，翁建宇，李其辉，苏健华，林秋雄，李扬秋
【摘要】 本研究确切了解CML患者异基因造血干细胞移植后bcr?abl mRNA的变化情况，为临床诊断早期复发提供实验依据。用实时荧光定量PCR方法检测15例慢性粒细胞白血病（CML）患者异基因造血干细胞移植前后78份外周血和骨髓标本的bcr?abl mRNA水平。结果表明， 移植前患者的bcr?abl mRNA水平较高，中位数为29.303％；移植后1个月时检测bcr?abl mRNA水平较移植前大幅度降低，中位数为0；移植后1年内，连续多次检测bcr?abl mRNA水平，变化模式不一致，但6个月后的总体水平较6个月前明显降低，移植1年以上的受者绝大多数bcr?abl mRNA检测不到，或偶可检测到，但水平极低（0.007％、0.004%和0.021％），所检测受者的骨髓和外周血像均正常；同期骨髓与外周血bcr?abl水平无明显差异，且变化趋势一致。结论：CML患者移植后早期bcr?abl水平变化起伏较大，连续动态检测可明确其变化趋势，有助于判断移植效果、指导临床，但6个月前检测到bcr?abl存在并不提示疾病复发；检测外周血bcr?abl或许更适于临床上对患者的随访。
【关键词】 慢性粒细胞白血病
Significance of Quantitative Detection of bcr?abl mRNA in Chronic Myeloid Leukemia Patients after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant
Abstract The objective of this study was to analyze the level of bcr?abl mRNA in peripheral blood (PB) after allogeneic stem cell transplantation (allo?SCT) in chronic myeloid leukemia patients, providing a experimental basis for diagnosing early relapse. bcr?abl mRNA levels in 78 PB and bone marrow (BM) samples from 15 CML patients after allo?SCT were detected by using real?time quantitative PCR. The results indicated that levels of bcr?abl mRNA before transplantation were high (median 29.303％) and decreased greatly (median 0) at the first month after allo?SCT. During the first year after allo?SCT, the patterns of serial bcr?abl transcripts varied in number, but the overall bcr?abl transcript levels significantly decreased at 6 months after allo?SCT. Majority of patients with undetectable or very low levels of bcr?abl mRNA were monitored after 1 year following transplantation. The hematological features of BM and PB in all detected patients remained normal. PB and BM bcr?abl values were not different significantly and had the similar trend of changes. It is concluded that the bcr?abl mRNA levels in CML patients change greatly early after allograft. Serial monitoring measurements for bcr?abl mRNA contribute to understanding the trend of change and effect of transplantation, also can be a guidance for starting therapy. But detectable levels of bcr?abl mRNA during the first 6 months do not indicate relapse. Measurements of bcr?abl mRNA of PB may be more suitable for routine monitoring long?term disease status in CML after allo?HSCT.
Key words chronic myelogenous leukemia; bcr?abl fusion gene; real?time PCR; minimal residual disease
异基因造血干细胞移植是目前治愈慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia，CML）的唯一方法，但移植后复发仍然影响着患者的长期生存和无病生存。定量检测bcr?abl融合基因的水平可以反映CML患者体内白血病细胞负荷，对于了解病情和预后判断有重要价值。此种检测方法目前已广泛应用于多种方法治疗后微小残留病 （minimal residualdisease，MRD）的检测［1-3］。在国内，CML患者造血干细胞移植后bcr?abl连续定量检测的报道甚少［4］。本研究采用目前标准的核酸定量方法实时荧光定量PCR检测CML患者异基因造血干细胞移植后bcr?abl mRNA水平的动态变化，为临床诊断早期复发提供实验依据。
标本采集
经细胞形态学、细胞组织化学和细胞及分子遗传学确诊的CML患者15例（男9例，女6例），中位年龄31.5（18-42）岁，确诊1年内在本院进行了异基因造血干细胞移植，中位观察时间12（3-36）个月，收集移植前后不同时间的外周血和骨髓标本共78份。
总RNA提取和逆转录
EDTA抗凝的外周血和骨髓标本采用红细胞裂解液裂解红细胞后收集白细胞，然后用TRIzoL试剂（Invitrogen公司产品）提取RNA，并应用随机引物和反转录酶试剂盒（Superscript III，Invitrogen公司产品）反转录合成cDNA第一链，步骤按操作说明书进行。
实时定量PCR
引物设计 检测bcr?abl融合基因的引物（B1和B2）和探针（B3）的核苷酸序列参照［5］，B1位于bcr基因的第13个外显子，B2与B3位于abl基因的的第2个外显子，可同时扩增b3a2与b2a2两种重排, 其扩增片段长度分别为165 bp和90 bp；选择abl作为参照基因，分别在abl基因组序列（ACCESSION X16416）中设计1对引物（A1和A2）及1荧光素标记探针（A3），分别位于该基因的第2、3外显子［6］，扩增片段长度为124 bp。引物和探针由上海英俊生物技术有限公司合成（表1）。
标准品的构建 分别在bcr基因的第13外显子与abl基因的第3外显子设计上游（C1）和下游引物（C2），以K562细胞的cDNA作为模板，进行PCR反应，总反应体积为20 μl，其中含1 μl cDNA，上下游引物0.5 μmol/L，dNTP 0.1 mmol/L，1.0 U Taq聚合酶（Invitrogen公司产品）和1×PCR缓冲液，反应在PCR扩增仪（MJ, 德国产品）中进行。共进行35个循环，每1循环包括：94℃ 1分钟（首次4分钟），59℃ 1分钟和72℃ 1分钟（末次10分钟），最后PCR产物保存于4℃。所扩增出的片段割胶纯化后连接入pMD18?T载体（TaKaRa产品），构建重组质粒，经序列分析证实后，将标准品DNA浓度分别调整为107、106、105、104、103、102、和10 copies/ 1 μl DNA 7组。该标准品可用于bcr?abl与abl 2个基因的定量检测。
实时定量PCR（real?time PCR） 每1标本分别进行2次bcr?abl和abl基因的定量检测，总反应体积为20 μl，其中含标准品或样品cDNA 1μL，引物0.3 μmol/L，探针0.2 μmol/L, 2×Taqman Universal Master Mix 10 μl（ABI），反应条件为50℃ 2分钟, 95℃ 10分钟, 95℃ 15秒, 60℃ 1分钟, 50个循环。反应在ABI PRISM 7000 Sequence Detector（PE公司产品）中进行。每次反应分别设标准品7个浓度（阳性对照）和无模板对照（阴性对照）。
统计学处理
骨髓与外周血bcr?abl mRNA水平的比较采用Wilcoxon signed ranks test，显著性检验水准为：α＝0.05。
结 果
实时定量PCR的敏感度和重复性
采用不同浓度的bcr?abl和abl基因重组质粒（标准品）评价本实验的敏感度和重复性，可重复的敏感度为5 copies/μl。日内差分析，同一次PCR扩增时，不同浓度的标准品均设5个平行管，CT值的变异系数（CV值）介于0.53%-0.88%之间。日间差（批间差）分析，不同批次的待测样品检测时，不同浓度的标准品CT值的变异系数（CV值）介于1.1%-3.2％之间。
异基因造血干细胞患者外周血bcr?abl检测情况
经实时定量PCR检测获得样本中bcr?abl和abl mRNA拷贝数的绝对数值，以bcr?abl/abl %来表示不同样本中bcr?abl融合基因mRNA的水平进行比较，定量检测结果阴性时，均采用巢式PCR确认。所检测的15例行异基因造血干细胞移植的患者，对其中5例移植前的bcr?abl mRNA水平进行了检测，结果水平均为较高的水平，中位数为29.303％（4.545％-54.103％），对移植前后bcr?abl mRNA水平比较发现移植后大幅度降低，中位数为0（0-0.089％），但不同个体降低的程度略有不同，移植前bcr?abl mRNA在中位数水平及以下的3例患者移植后1个月bcr?abl mRNA均检测不到，另外2例移植前bcr?abl mRNA水平分别为54.103%和37.372%的受者，移植后1个月分别为0.089%和0.013%，降低2个对数级以上。
移植后1年内，对8例受者连续进行3-6次bcr?abl mRNA定量检测，其变化趋势不同。8例中3例bcr?abl mRNA水平持续降低（例1移植后1、2、3月分别为0.089％、0.067％和0；例2移植后1个月为0.013％，在2、3、6月时检测不到；例3移植后1、3、6月均检测不到）（图1A）。其余5例受者bcr?abl水平呈波动状态（例4和例5移植后1、3、6、9月分别为0、0.103％、0.162％、0和0.176％、0.002％、0.029％、0.017％；例6移植后1、2、3、6、12月分别为0.395％、0.654％、0和0.01％；例7移植后1、2、4、6、9月为0.138％、0.134％、0、0和0.018％；例8移植后3、6、7、9、10、12月分别为0、0、0.029％、0、0.011％和0.031％）。可以看出6个月以后bcr?abl mRNA的总体水平较6个月前明显降低（图1B）。移植1年以上的7例受者，其中4例bcr?abl mRNA连续3-4次均检测不到，另外3例则分别检测到1次低水平的bcr?abl存在（0.007％、0.004%和0.021％），检测的时间间隔为2－6个月。移植后发生急性移植物抗宿主病（aGVHD）的2例受者，移植后1-6个月连续3次bcr?abl mRNA检测不到或检测到的水平极低（0.013％），而发生慢性移植物抗宿主病（cGVHD）者有5例，可检测到的bcr?abl mRNA水平高低不等（0.089％、0.067％、0.029％、0.002％、0.011％和0）。另外，所检测受者的外周血与骨髓像持续正常。
骨髓与外周血bcr?abl mRNA检测情况
对移植后不同时间点同期进行骨髓和外周血bcr?abl mRNA水平检测，其中5次骨髓与外周血bcr?abl mRNA均检测不到，在骨髓可检测到低水平bcr?abl mRNA，而在外周血检测不到者3次，外周血可检测到而骨髓检测不到者2次，二者均检测到者7次（表2）。统计学分析结果显示，骨髓与外周血bcr?abl mRNA水平的差异无显著性（Wilcoxon signed ranks test，p=0.582）。骨髓与外周血连续动态检测的1例受者，bcr?abl mRNA变化趋势一致（图2）。
讨 论
近年来，定量监测CML患者bcr?abl mRNA水平在疾病的疗效判断和预后分析中得到了广泛应用。由于检测方法多样，欧洲抗癌协会(Europe Against Cancer program, EAC)进行了一项大规模的研究，旨在建立定量检测白血病MRD的标准方法［7］。参照EAC的经验，本研究建立了定量检测CML患者bcr?abl mRNA的方法。所不同的是，本研究中将bcr?abl和abl基因的部分序列插入同一载体，即目的基因与内参共用一套标准品进行定量，增强了二者的可比性，其结果也更为准确可靠。
本研究中检测了部分患者同期骨髓和外周血bcr?abl mRNA水平，结果显示二者无明显差异，与国内外报道相符［7，8］；而且同期连续动态检测1例受者的骨髓和外周血显示，二者bcr?abl mRNA水平变化趋势一致。这提示移植后检测外周血bcr?abl mRNA水平可更简便地了解患者体内MRD情况及其变化趋势，尤其是长期常规随访检测的移植受者，而对同一例受者，若将骨髓与外周血样本交叉进行检测，则会影响对疗效的判断。然而，最近有文献报道，化疗过程中骨髓与外周血bcr?abl mRNA检测结果的一致性稍差［9］。
移植后1个月，bcr?abl mRNA水平大幅度降低，但不同个体降低的程度略有不同，移植前检测的5例患者，其中bcr?abl mRNA水平相对较高的2例在移植后1个月时均检测到bcr?abl存在，较低的3例则检测不到。因此，患者移植前bcr?abl mRNA的水平即白血病细胞负荷可能也是影响移植后bcr?abl mRNA水平高低的因素之一。移植后1年内，连续检测bcr?abl mRNA水平变化较大，尤其是前6个月，而6个月后多处于相对稳定的低水平状态。前者可能与患者体内的移植物抗白血病效应和残留白血病细胞的恶性增殖活性两方面因素的强弱有关。移植后早期二者处于不稳定状态。本研究中GVHD的发生情况与bcr?abl mRNA水平之间的关系也提示了该种可能性，发生aGVHD的受者，bcr?abl mRNA检测不到或水平很低，伴有cGVHD的受者，bcr?abl mRNA水平则高低不等，也符合Kaeda等［3］的研究结果。移植1年后，bcr?abl mRNA水平趋于稳定，多检测不到或仅检测到稳定的低水平，患者均持续处于完全缓解状态，这些低水平bcr?abl存在的临床意义尚需进一步观察。
总之，移植后外周血和骨髓bcr?abl mRNA检测结果无显著性差异；移植后早期（1年内），受者体内bcr?abl变化较大，连续检测，方可掌握受者体内bcr?abl的变化趋势，明确其存在的临床意义，并采取适当的措施。而单次检测的结果对预后判断及是否需要的意义有限，尤其是移植后6个月内检测到bcr?abl多不提示疾病复发。本研究的数据以及目前的文献报道也均未显示需要立即治疗的bcr?abl水平的临界值［11，12］。
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