原发性血小板增多症血小板更新率与血栓形成的关系
作者：高新谱，刘正敏，李健，韩雪莹
【摘要】 为了对原发性血小板增多症血小板更新率（turnover）变化与血栓形成的关系进行分析，根据有无血栓症状将26例原发性血小板增多症（ET）患者分成两组，应用流式细胞术检测网织血小板（RP），选择26名健康献血者作为对照。应用羟基脲加α-干扰素对血栓病例进行。结果表明：有血栓ET病例的RP百分数（14.8%±7?2%）比无症状病例的（4.5%±2.3%）和健康对照的（3.3%±1.5%）显著增高（P＜0.05）；RP百分数在无血栓病例和健康对照中无差异。有血栓病例的RP绝对值比无血栓病例显著升高〖（176±37）×109/L vs （46±12）×109/L］。有血栓ET病例接受羟基脲加α-干扰素治疗后，RP百分数和绝对数均明显降低（P＜0.05）。结论： ET病例形成血栓时，与无血栓病例和健康对照相比，其RP百分数和绝对数均显著升高，有血栓的ET患者用羟基脲加α-干扰素治疗疗效良好。
【关键词】 原发性血小板增多症
Correlation of Thrombosis with Increased Platelet Turnover in Essential Thrombocythemia
Abstract This study was aimed to investigate the correlation of thrombosis with increased platelet turnover in essential thrombocythemia. According to presence or abscence of thrombosis，26 patients with ET were divided into two groups. Reticulated platelets (RP) were measured by flow cytometry and 26 healthy volunteers were selected as healthy controls. The ET patients with thrombosis were treated with hydroxyurea and interferon-α. The results demonstrated that the ET patients with thrombotic events had a significantly higher RP percentage (14.8%±7.2%) than that in both asymptomatic ET patients (4.5%±2.3%) and normal control (3.3%±1.5%)，(P＜0.05)；the RP percentage in asymptomatic ET patients did not differ significantly from controls. ET patients with thrombosis also had a significantly higher absolute RP (ARP) count than those in ET patients without thrombosis 〖（176±37）×109/L vs （46±12）×109/L］. The ET patients with thrombosis were successfully treated with hydroxyurea plus INF-α，the RP percentage and ARP counts obviously reduced. In conclusion，when the ET patients had thrombotic events，those patients had a significantly higher RP percentage and ARP compared with patients without thrombosis and healthy controls. The ET patients with thrombosis were successfully treated with hydroxyurea plus INF-α.
Key words essential thrombocythemia；thrombosis；platelet turnover；reticulated platelet
原发性血小板增多症（essential thrombocythemia，ET）属于骨髓增殖性疾病（MPD），血小板持续升高，有反复自发性出血和血栓并发症，被认为与异常的血小板功能和(或)升高的循环血小板数有关。然而，在外周血血小板计数（blood platelet count，BPC）升高情形下，针对血栓和出血并发症的特殊危险因素相对地说人们并不明确。目前还没有简单可行的检测血小板在体内活性的方法。检测网织血小板（reticulated platelets，RP）是一种快速而简单的血小板更换率的途径。血小板更换率为ET患者发生血栓时提供了有价值的临床信息。为此，我们探讨了RP百分值升高是否与ET患者血栓形成相关。
材料和方法
研究对象
原发性血小板增多症患者的诊断均符合诊断标准［1］，共26例，女17，男9（年龄20-81岁，平均52岁），试验前均未接受过化疗、生长因子或阿斯匹林等药物治疗。所采用的血栓形成确认方式有：红斑性肢痛病的基本症状、血管造影术、超声波及核磁共振检查等。选择26例健康献血者作健康对照。
血样的准备
所有样本均在采取治疗措施前采集。26例ET中9例血样是在血栓发生时或其后24小时内采集的；17例血样是在血栓症状出现前采集的，其中7例在接下来的16天内出现了血栓并发症。对16例发生血栓的ET患者进行了进一步的研究。采集3 ml静脉血，用EDTA-Na2（1.5 mg/ml）抗凝。用MEK-6318血细胞自动分析仪进行血小板计数（BPC）。血小板样本的制备：血样离心得富含血小板血浆，用缓冲液洗涤后，1%多聚甲醛4℃固定2小时，然后再洗涤配成200×109/L悬液。
标记及测定［2］
将50 μl稀释到100×109/L血小板悬液与450 μl噻唑橙（TO）混匀，22℃避光孵育1小时；PBS作空白对照，流式细胞术测定荧光强度，吸收波488 nm，激发波530 nm，测得直方图，按空白对照设定标尺，阳性率设为1%，同一标尺用于TO染色的病例标本，结果即为RP百分数。取50 μl 200×109/L血小板悬液与10 μl CD41-FITC单克隆抗体混匀，4℃避光孵育25分钟，用FACScalibur流式细胞仪测定阳性细胞率。RP的绝对数（absolute reticulated platelets，ARP）是由RP百分数×BPC得出的。
统计分析
所测数据以x±SD表示，用软件SPSS 11.0进行统计学计算。
结 果
网织血小板对比检测
检测的结果详见表1。形成血栓的病例有16例，占61?5%，平均年龄55±16岁；无血栓病例10例，占38.5%，平均年龄为51±23岁。有无血栓病例间的年龄和性别均无显著性差异。有血栓症状ET病例的RP百分数（14.8%±7.2%）比无症状病例者（4?5%±2.3%）和健康对照者（3.3%±1.5%）显著增高（P＜0.05）；无血栓病例和健康对照中RP百分数无差异。而且血栓病例的ARP比无血栓病例显著升高〖（176±37)×109/L vs （46±12）×109/L］。16例血栓病例RP百分数均超过了6%（健康对照平均值+2SD）。经后16例血栓病例中3例RP百分数超过6%，随后又有血栓症状出现，剩余13例RP百分数均低于6%，血栓症状逐渐缓解；而无血栓症状10例都没有超过6%。Table 1. Comparison of reticulated plalelets between diffe-rent groups (略)
治疗效果
结果见表2。16例血栓ET在随后的6-52周内，均接受了溶栓及羟基脲加α-干扰素治疗［3，4］，取得了明显的效果，RP百分数从（14.8±7.2）%降到（4.0±1.9）%（P＜0.05），ARP从（176±37）×109/L降到（29±11）×109/L（P＜0.05），BPC从（1 202±127）×109/L降到（336±182）×109/L(P＜0.05），Rtc从（3.6±0.6）%降到（1.3±0.2）%（P＜0?05）。经过治疗后，其中13例患者的RP百分数范围是2.1%-5.9%，低于6%的危险水平，他们的红斑性肢痛症逐渐得到缓解，并且在随后的一段时期内没有形成血栓。另外，3例患者的RP百分数是6?5%，16.8%，22.9%，均高于6%的危险水平，在随后又有血栓形成，但他们的红斑性肢痛症较之前有所缓解。Table 2. Changes of BPC，RP，ARP and Rtc before and after treatment（略）
讨 论
原发性血小板增多症是发病率最低的MPD，起病缓慢，在临床上不易与真性红细胞增多症和慢性粒细胞白血病相鉴别，由于血小板计数过高且功能异常，易发生栓塞和出血以致危及生命。RP是骨髓释放出的新生血小板，其胞浆中含有RNA，可以被TO荧光染色。基于这一点，应用流式细胞术对ET患者的RP进行检测。所有有形成血栓的ET病例的RP百分数和ARP比相应无血栓病例显著升高，揭示了RP百分数和ARP的升高与ET血栓形成密切相关（P＜0.05）。并且，在RP百分数＞6%时ET病例全部出现血栓并发症；而在RP百分数＜6时，即使ARP比健康对照显著增加，但也没有ET病例发生血栓症状。这进一步揭示出RP百分数的变化对ET发生血栓危险性会产生更直接的影响。
本研究还发现无症状ET病例RP百分数在正常范围内，这与先前报道一致［5］。这些数据显示BPC升高时血小板更新率是受网织血小板影响的，而在原发性血小板减少性紫癜（ITP）患者中RP百分数升高同样影响了血小板更新率的升高［6］。有学者认为，血栓病例RP值升高使得血小板更新率升高是由于血小板进入大动脉或较小但更广泛的小动脉形成血凝块（红斑性肢痛症）造成了丢失所致［7］。也可能是，RP升高引起血小板生理功能异常，从而导致血小板黏附到内皮细胞、白细胞或其他血小板上，没有形成真正的血凝块，这些血小板就从外周血循环中被移除［7］。此外，在有症状深部静脉血栓或动脉血栓病例BPC正常时并未发现RP百分数的升高［7］。虽然如此，但是对于RP百分数升高与血栓形成相关的另一种可能解释是：动脉血小板沉积物分布相当广泛，导致血小板更换率升高。从病理生角度看，血栓形成倾向的ET病例有潜在的、与较高血小板更新率相关的血小板病理改变，而血小板更新率升高的ET病例有潜在的形成血栓的危险。
对于合并血栓的ET病例，在使用溶栓药物及羟基脲诱导后，应用α-干扰素进行了维持治疗，取得了良好效果，所有病例的RP百分数和ARP均降低了，伴有红斑性肢痛症症状的改善，近期也未形成血栓。由此看来，RP百分数和ARP的这种改变能够得到适当抗血小板治疗的纠正。RP检测可以提供一种非侵入性、简单可行的评测血小板动力学的手段，从而监视ET的治疗反应。
总之，当ET患者没有血栓并发症时，RP百分数会是正常的；无症状病例血栓形成前期和后来形成血栓时，RP百分数和ARP都是升高的，这与血小板更换率的升高一致。不过，还需要更大标本量的前瞻性研究，对无症状病例进行连续RP检测，以确定是否能够在RP百分数升高和血栓症状产生之间获得足够的时间，以便于采取较早的、可能更成功的医疗干涉。
【】
1Murphy S，Peterson P，Iland H，et al. Experience of the Polycythemia Vera Study Group with essential thrombocythemia: a final report on diagnostic criteria，survival，and leukemic transition by treatment. Semin Hematol，1997；34: 29-39
2Richards EM，Baglin TP. Quantitation of reticulated platelets: methodology and clinical application. Br J Haematol，1995；91: 445-451
3杨仁池，华宝来，钱林生等. 原发性血小板增多症94例临床分析. 临床血液学杂志. 2000；13: 8-10
4杨崇礼，卢学春，李孝义. 原发性血小板增多症的治疗. 中华血液学杂志. 2001；22: 502-503
5van-Genderen PJ，Michiels JJ，van-Strik R，et al. Platelet consumption in thrombocythemia complicated by erythromelalgia: reversal by aspirin. Thromb Haemost，1995；73: 210-214
6Romp KG，Peters WP，Hofmann M. Reticulated platelet counts in patients undergoing autologous bone marrow transplantation: an aid in assessing marrow recovery. Am J Hematol，1994；46: 319-324
7Rinder HM，Schuster JE，Rinder CS，et al. Correlation of thrombosis with increased platelet turnover in thrombocytosis. Blood，1998；91: 1288-1294
