异种输血——猕猴受输猪红细胞的初步研究
作者：檀英霞，季守平，卢雁平，张成林，李立立，宫锋，张金国，章扬培
【摘要】 本研究的目的是改造猪红细胞（pRBC）表面抗原，使之与灵长类动物相容，以探讨异种输血的可能性。结合使用α半乳糖苷酶(AGL)酶解和甲氧基聚乙二醇（mPEG）修饰改造猪红细胞表面异种抗原，并输注给猕猴，观察pRBC在猕猴体内活存时间及安全性；使用免疫抑制剂（蛇毒因子CVF和地塞米松）延长pRBC在猕猴体内的存活时间；建立失血性贫血猕猴模型，观察输注pRBC失血性贫血猕猴的可能性。结果表明： AGL酶解能够去除猪红细胞表面主要异种抗原（α－Gal抗原），减弱其与猕猴血清的凝集反应，酶解技术与mPEG修饰技术结合可以使猪红细胞与猕猴血清更为相容。异种输血试验表明，双修饰的pRBC在猕猴体内存活时间为12小时，使用免疫抑制剂后，可延长至40小时；pRBC在猕猴体内8小时的存活率为38％，在输注pRBC的8小时内，失血猕猴的血红蛋白和红细胞压积可维持在失血前的正常水平。结论：改造后的pRBC可安全地输注给猕猴，改善失血猕猴的贫血症状，提示用猪红细胞进行异种输血是可能的。
【关键词】 猪红细胞
Preliminary Study on Xenotransfusion from Porcine Red Blood Cell into Rhesus Monkey
Abstract In order to study the possibility of xenotransfusion from porcine red blood cell (pRBC) to primate，the antigens on pRBC surface were modified to make it more compatible to primate sera. Porcine RBCs were subjected to both enzymatic removal of membrane α-Gal antigens with recombinant α-galactosidase (AGL) and covalent attachment of succinimid propionate-linked methoxypolyethyleneglycol (mPEG-SPA) to camouflage non-αGal antigens. The effects of double modifications were determinated by hemagglutination and clinical cross-match testing with rhesus sera. In vivo clearance rates and safety of modified pRBCs were measured after it was transfused into Rhesus monkey with or without immunosuppressant treatment .The validity of pRBC was detected in exsanguine Rhesus monkey model. The results showed that AGL could effectively remove α-Gal xenoantigens on pRBC membrane and reduce hemagglutination. The combination of mPEG modification with AGL treatment could significantly increased compatibility between pRBCs and Rhesus monkey sera. Modified pRBCs were detectable in Rhesus monkey blood at 12 hours after transfusion，and their survival time was 40 hours in the immunosuppressant-treated Rhesus monkey. In vivo survival rates of pRBCs were 38% in exsanguine Rhesus monkey at 8 hours after transfusion，and during that time，the hemoglobin and hematocrit of Rhesus monkey were maintained at the same level as before it lost blood. It is concluded that the modified pRBC can be safely transfused into Rhesus monkey and relieve the anemic symptom exsanguine Rhesus monkey . It suggested that pRBC can be hopefully used as a blood substitute for primate and human in the future.
Key words porcine red blood cell；Galα1-3Gal；α-galactosidase；methoxypolyethyleneglycol；xenotransfusion blood
血液供应的严重短缺是临床输血面临的难题。猪血液生理生化指标与人类非常接近，无传染甲肝、乙肝和艾滋病等疾病的危险，因而近年来人们开始探讨猪红细胞作为人类红细胞替代品的可能性，以缓解血源紧张的矛盾［1-4］。
猪红细胞输给人体会产生强烈的排斥反应，这主要是由猪红细胞表面的异种抗原引起的。研究证明猪红细胞表面存在两类异种抗原，即α-半乳糖(α-Gal)抗原和非α－半乳糖(non-Gal)抗原。α-Gal抗原是主要异种抗原，它表达于除人和旧大陆猴外的所有哺乳动物体内，只是种类和个体间表达量有所差异［5-7］。人体内存在天然抗-α-Gal抗体，如果将猪细胞、组织和器官移植给人和灵长类， 人和灵长类会出现超急性排斥反应（HAR），导致移植物被迅速清除。研究表明，使用α半乳糖苷酶（AGL）能有效清除猪细胞表面Galα1-3Gal抗原（α-Gal抗原）末端的α-Gal残基，减弱HAR的程度，延长移植物的存活时间［2，8，9］。甲氧基聚乙二醇（mPEG）是无毒性、无免疫原性的高分子化合物，已被用于修饰蛋白和多肽类药物，延长药物的半衰期，提高治疗效果。国外和我们前期的研究均表明，mPEG可与人红细胞膜表面的-NH2、-OH共价结合，非特异性地遮蔽血型抗原，修饰后的红细胞与相应抗血清的凝集反应减弱或消失［10，11］。本研究结合AGL酶解技术和mPEG修饰技术，改造猪红细胞（pRBC），检测改造后的pRBC与猕猴血清的相容性。在此基础上，把双修饰的pRBC输注到猕猴体内，观察双其在猕猴体内的活存时间，探讨异种输血的可能性。
材料和方法
血液和试剂
猪血液为无特定病原体的猪血，由北京市SPF育种中心提供；抗体：Isolectin B4-Biotin（Sigma），Streptavidin-FITC（Southern Biotech，USA）；试验猕猴及猕猴血清由北京市动物园提供；基因重组咖啡豆α－半乳糖苷酶（rC－AGL，简称AGL）为本研究室研制；mPEG-SPA（20 kD）购自美国Nektar。
血液标本的采集与处理
颈静脉采猪血，肝素抗凝，4℃保存。抗凝的全血500×g离心5分钟，弃上层血浆，生理盐水洗涤沉淀红细胞。
AGL改造猪红细胞及α-Gal抗原清除
取压积pRBC，用等渗磷酸-柠檬酸-NaCl缓冲液（58 mmol/L Na2HPO4，21 mmol/L柠檬酸C6H8O7·H2O，77 mmol/L NaCl，pH 5.6±0.5，PCS）洗涤4次，按每毫升PCS红细胞悬液中添加酶量为0、50、100 U，分别加入AGL，26℃反应2小时，PBS（pH 7.4）洗涤。
用PBS将酶解前后的pRBC稀释为0.2％悬液，1.5%的多聚甲醛固定，室温过夜，加入生物素标记的IB4凝集素，24℃反应2小时，PBS洗涤后加入FITC-链亲和素，24℃反应30分钟，PBS洗涤，用流式细胞仪（FACS Calibur，Becton Dickinson）检测红细胞表面的荧光强度，α-Gal抗原的清除率。
酶解后的猪红细胞(EpRBC)的mPEG-SPA修饰
用PBS（pH 8.0）洗涤酶解后的pRBC 4次，稀释成12%细胞悬液，在红细胞悬液中加入mPEG-SPA至终浓度为1.0，2.0，3.0 mmol/L，混匀后25℃反应1小时，PBS洗涤红细胞。
红细胞与mPEG结合的两相法检测
报道［12，13］，PEG8000 (Sigma) 和葡聚糖T500 (Pharmacia) 组成的两相系统(5%葡聚糖 T500、3?5% PEG8000、0.15 mol/L NaCl、6.84 mmol/L Na2HPO4、3.16 mmol/L NaH2PO4，pH 7.4)可分离mPEG修饰的红细胞。用50 ml的聚丙烯离心管盛两相溶液，室温静止过夜，分层后，用吸管吸取上相（PEG），试管底部扎孔收集下相（葡聚糖），弃中间层（上下相在3天内使用）。取上、下相各500 μl于EP管中混合，mPEG-pRBC和对照红细胞（108 cells/ml）各10 μl加到此EP管中，上下颠倒20次，静止15分钟，红细胞在两相中分配（设重复），计算上相中的细胞数与加入到系统中总细胞数的百分比，即为分配率，亦即被修饰的红细胞比率。
双修饰的pRBC与猕猴血清的配血实验
2.0%的pRBC悬液20 μl，与40 μl猕猴血清混合，250×g离心30秒，肉眼和显微镜下观察红细胞凝集程度。
少量输血实验
5 ml AGL和mPEG修饰的压积pRBC，PBS(pH 7?2)洗涤，加入异硫氰酸荧光素（FITC，Sigma）37℃反应20分钟，生理盐水洗涤，重悬至压积为50％。在输血前，将受血猴麻醉，分为3组： ①自身输血组，受血猴取出10 ml猴血，离心去白细胞，荧光素标记后回输；②无免疫抑制剂试验组，将10 ml经FITC标记的双修饰pRBC经静脉输入受试猕猴（体重约为6.0 kg）；③免疫抑制剂试验组，将10 ml经FITC标记的双修饰pRBC经静脉输入受试猕猴，受试猴接受免疫抑制剂处理。具体免疫方法为：在输血前24小时，按0.05 mg/kg体重的量将蛇毒免疫抑制因子〖眼镜蛇毒因子（cobra venom factor，CVF)，院昆明动物研究所研制］静脉注射给受试猴，并在输血前半小时静脉注射地塞米松（5 mg，0.5 mg/kg）以及第二次注射CVF（200 μg，0?02 mg/kg），输血后1小时再次静脉注射地塞米松（5 mg）。整个试验过程中，监测受试猴的心率、血压；在输血后的5、10、15、30分钟及1、2、4、8、12、24、28、32、36、40、44、48小时取血，流式细胞仪检测荧光细胞百分率，计算pRBC在猕猴体内的活存时间，并在输血4小时后进行血常规、血生化和尿常规检测。
失血猴模型输血实验
从猕猴体内放血12％（体重10 kg，放血100 ml），建立失血性贫血猕猴模型。将实验分为两组，其中一组输入相同体积代血浆（羟乙基淀粉-盐水注射液），另一组使用免疫抑制剂处理受试猴（方法同少量输血试验），输入相同体积双修饰的pRBC (40 ml压积红细胞)和代血浆（50 ml），静脉滴注输血，然后检测失血前后及输血/液后不同时间点的血红蛋白(Hb)和红细胞压积(Hct)，并在放血前及输血/液4小时后进行猕猴的血生化、尿常规检测，记录猕猴心率、血压变化。
结 果
AGL酶解改造后的猪红细胞表面抗原分析
IB4凝集素可特异地与以α-Gal为末端的多糖结合［14］，用来检测酶解前后pRBC表面α-Gal抗原的变化情况。流式细胞术检测结果表明，以未酶解pRBC的荧光标记率为100％，使用≥50 U/ml的AGL可有效清除pRBC表面主要异种抗原—α-Gal抗原，清除率达99.42%（图1）。
红细胞与mPEG结合的两相法检测
图2为mPEG-SPA修饰的酶解后的猪红细胞在两相中的分配，从图中可看出未修饰的红细胞分布在界面下相，mPEG修饰的红细胞均匀分布在上相，mPEG-SPA浓度为2.0 mmol/L时，＞80%的mPEG-RBC分布在上相，mPEG-SPA为3.0 mmol/L时，红细胞的修饰率大于90%。这种技术对于规模化分离回收被修饰的红细胞和应用于输血是非常重要的。
AGL酶解和mPEG-SPA遮蔽双修饰的pRBC与猕猴血清的配血试验
AGL基本清除了pRBC表面的α-Gal抗原后，配血试验显示，EpRBC与猴血清仍然有凝集反应，但凝集程度有所减弱（从++++降到++），凝集时间延长。进一步使用mPEG-SPA修饰EpRBC，镜检结果表明，随着mPEG-SPA浓度的升高，修饰的pRBC与猕猴血清的盐水凝集反应逐步减弱，当mPEG浓度为2.0 mmol/L时，盐水凝集反应完全消失（图3），这说明AGL和mPEG-SPA双修饰能有效清除和遮蔽猪红细胞表面主要和非主要异种抗原。
少量输血试验
所有受试猴在输血过程中和输血后，呼吸、心率、血压和血氧饱和度均无大幅度的波动，无明显的输血反应症状出现。流式细胞术检测结果表明，输入的pRBC约占猕猴体内总红细胞数量的4％左右，这与理论值是一致的，以此为100％，输血后不同时间点pRBC存活的百分率。检测结果表明：自身回输组，3天后检测红细胞存活率在90%以上；无免疫抑制剂试验组，在输血后12小时时仍可检测到FITC标记的pRBC；免疫抑制剂试验组，输血8小时时有38%pRBC存活，而在输血40小时后，猕猴体内仍可检测到荧光标记的pRBC（图4）。
受试猴的尿常规和血生化等多项指标检测表明，各组的血清K、尿素氮，胆红素和转氨酶等均有一定程度的上升。值得注意的是，无免疫抑制剂试验组总胆酸升高了15倍。尿常规指标中，无免疫抑制剂试验组受试猴在输猪红细胞后，尿液中出现大量的尿胆原，尿蛋白和尿红细胞（均为+++）；而免疫抑制剂组在输猪红细胞后，尿液中未出现尿胆原和尿蛋白，仅红细胞有略微的增加，与自身回输组相似（表1）。这些结果说明使用免疫抑制剂可减轻异种输血的免疫反应。Table 1. Blood and urine biochemical analysis of autologous blood transfusion Rhesus monkey and transfused pRBC Rhesus monkey with or without immunosuppressant (CVF) treatment（略）
失血性贫血猕猴的pRBC
为了检测双修饰后pRBC是否在猕猴体内行使红细胞的功能，我们建立了失血性贫血猕猴模型。猕猴失血约12％后，输入代血浆-羟乙基淀粉，恢复血容量，失血猕猴出现贫血症状，表现为面色苍白，血红蛋白和红细胞压积降低等（3小时内Hb降低了15%，RBC降低了13%）（图5）。失血后3小时，猕猴血清中乳酸脱氢酶(LDH，乳酸脱氢酶是一种糖酵解酶)的水平升高了约5倍，说明动物无氧酵解水平上升，提示动物处于缺氧的状态；而输入双修饰pRBC治疗的贫血猕猴，面色红润，输血3小时后，LDH仅为放血前的1.5倍，明显低于未治疗贫血猴（表2）；其它生化指标变化不大。在输血后8小时内，受试猴体内血红蛋白和红细胞压积与失血前一致（图5），维持正常水平，而未治疗的猕猴在失血18小时内一直表现典型的贫血症状。这说明经酶解和mPEG包裹的双修饰猪红细胞输给猕猴在一定时间内可发挥正常的携氧功能，因此失血猕猴未出现失血后的贫血症状。这一结果提示异种输血的可能性。Table 2. Blood and urine biochemical analysis of hemorrhagic Rhesus monkey and pRBC treated hemorrhagic Rhesus monkey（略）
讨 论
据统计，我国每年的血液需求量为50亿毫升，但目前的供应量仅为16亿毫升，供需之间存在巨大差距，血液来源问题已经成为制约临床输血应用的瓶颈。在实行义务献血法后供需矛盾更显突出，很多病人由于不能及时获得输血治疗而延误抢救的最佳时机。为解决这一矛盾，人们开始寻找红细胞代用品，其中以化学修饰的牛血红蛋白和纳米氟碳乳剂最为成功，但它们不完全具备有形红细胞的功能。猪红细胞无论从形态、结构，还是生理功能、生化特征，都与人红细胞极为相近，近年来逐渐成为人红细胞代用品研究的对象。
研究表明，将猪的细胞或器官移植到人体内，会引起强烈的免疫排斥反应，主要是超急性排斥反应（HAR），人血液中的天然抗体与猪细胞表面主要异种抗原α－Gal结合，激活补体系统，导致在数分钟内被排斥。去除猪细胞表面的α－Gal抗原、抑制补体系统激活、清除人体内的天然抗体是克服HAR的三条技术途径。异种输血比异种器官移植更有可能实现，因为成熟红细胞无核，缺乏细胞器，使用AGL可永久去除pRBC的α-Gal抗原。
为克服异种输血的HAR，我们首先使用基因重组咖啡豆α-半乳糖苷酶(AGL)处理pRBC。结果表明，AGL可以有效地清除pRBC表面的α-Gal抗原，AGL浓度为50 U/ml时，抗原清除率达到99.4%以上。然而，AGL处理的pRBC与猴血清仍有弱凝集反应。这可能是由于pRBC表面还存在non－Gal抗原或残存少量的α-Gal抗原分子，因此必须将异种抗原完全去除或遮蔽。为此，我们进一步用SPA端基活化的mPEG修饰AGL处理过的pRBC，mPEG-SPA与红细胞膜蛋白以酰胺键的形式共价结合［10］，其形成的高度水化膜和柔韧的长链阻止抗体等大分子的进入，对抗原起到空间遮蔽作用。随着mPEG-SPA浓度的升高，pRBC与猕猴血清的盐水凝集反应进一步减弱，当mPEG的浓度大于2.0 mmol/L，凝集反应消失，提示双修饰的pRBC与猕猴血清基本兼容。Doucet等［3］的研究结果表明，双修饰对猪红细胞的形态、结构、功能和变形性等均无明显影响，我们前期的工作也得到了相同的结论。
据报道，Eckermann等［2］曾用pRBC、AGL处理的pRBC、AGL处理的pRBC配合使用免疫抑制剂（CVF，补体抑制剂）及结合使用BSA-Gal分别输给1只猩猩，试验结果发现，pRBC相应的存活期分别为不到15分钟、2小时、24小时和72小时。我们将双修饰的pRBC对未处理猕猴进行少量输血试验，结果显示 pRBC相应的存活期为12小时，比Eckermann报道的存活时间长5倍。我们的实验还表明，使用CVF和地塞米松处理猕猴进行大量输血试验，输血8小时后约有38％的pRBC存活，输血40小时后仍可检测到pRBC。结果说明mPEG可以遮蔽猪红细胞表面的non-Gal抗原，使之与猕猴体内的天然抗体的反应能力减弱，降低迟发型排斥反应的程度；双修饰的方法明显优于AGL单处理法，能显著降低异种输血排斥反应的程度。
我们首次用双修饰的pRBC配合使用免疫抑制剂治疗失血性贫血猕猴，输血后8小时内，受血猕猴的Hb和Hct恢复到和失血前水平，失血猴未出现面色苍白等贫血症状，说明经酶解和mPEG包裹双修饰的猪红细胞可在一定时间内在猕猴体内发挥正常的携氧功能，因此失血猕猴未出现贫血症状，尤其是在输入修饰的pRBC后，血清中LDH水平升高幅度较贫血猴低，说明输入的猪红细胞能够缓解动物的缺氧状态。
在给猕猴输入双修饰的pRBC的异种输血过程中，猕猴的呼吸、心率、血压和血氧饱和度等指标均没有明显变化，这提示在异种输血过程中受血猕猴的生命指标是平稳的，未出现剧烈的输血反应。无免疫抑制剂试验组猕猴的尿胆原，尿蛋白和尿红细胞均出现强阳性，而使用免疫抑制剂试验组和自身回输对照组在尿中仅检测到少量的红细胞。我们推测，其机理是使用CVF抑制受试猴体内的补体系统，减弱了IgG介导的补体激活途径，减轻了肝脏和肾脏损伤，因此免疫抑制剂试验组的血生化和尿常规检查指标均较无免疫抑制剂组正常。
试验结果提示将经修饰的pRBC输注给猕猴，即异种输血是有可能的。本研究结果为实现将pRBC作为人红细胞代用品，以及用pRBC抢救失血的珍稀动物，提供了有意义的。
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