应用寡核苷酸芯片进行HLA-DQA1位点基因分型
作者：王彤，王天骄，何群，张玉魁，马佳明，侯伟建，
王绍成，潘忠诚，赵雨杰
【摘要】 为了构建HLA-DQA1位点寡核苷酸分型芯片并籍此建立一种应用于HLA系统基因分型的集成化技术平台，在多态性集中的HLA-DQA1第二外显子区域，自行设计一套寡核苷酸分型探针；采用本实验室自建的方法，制成寡核苷酸芯片。提取的基因组DNA以组间特异性引物，单侧引物荧光标记，行不对称扩增。杂交后扫描检测分析杂交信号，确定HLA等位基因型；分型结果以标准DNA和PCR产物测序检测。结果表明： 100例样本芯片分型全部成功，其中50例标准DNA与其模板相符，另50例临床样本中随机选取的10例与其测序结果相符，其中2例分型结果不完全；重复杂交实验中，位点重现率95%。结论： 研制的HLA-DQA1等位基因分型芯片，其准确性和重现性理想，且操作简便、快捷，有广泛的应用前景。
【关键词】 基因分型
HLA-DQA1 Genotyping by Using Oligonucleotide Microarrays
Abstract In order to fabricate the HLA-DQA1 genotyping chip and develop an integrated，parallel technical platform to type HLA system，a pair of primers and a set of probes were designed according to the sequences of HLA-DQA1 exon 2，where the polymorphism is concentrated. The oligonucleotide chip was made with the methods developed in our laboratory. The target DNA was asymmetrically amplified with the labeled sense primer. The signals were scanned and analyzed after the hybridization between microarray and PCR product. The allele types of the samples were idenlified. The result was verified by the standard DNA and DNA sequencing. The results showed that the genotyping was successfully carried out in 50 standard DNA samples and 50 clinical samples. Among them，results of the 50 standard DNA samples matched their templates. In the other 50 samples，results of the randomly selected 10 matched their sequencing results except that two of them got the incompletely result. In reproducible tests，the signal reappear rate was 95%. It is concluded that HLA-DQA1 genotyping by using our array system is simple and convenient with satisfied accuracy and reproducibility.
Key words HLA-DQA1；genotype；oligonucleotide chip
组织配型的情况是影响器官移植成活率的关键因素，同时，特定的HLA基因座位还和某些疾病相关联，因此HLA的分型工作亦受到广泛重视。到目前为止，国内外的HLA的分型研究仍多集中于A、B、DR位点。近年来，组成较为复杂的Ⅱ型位点因与疾病有较多关联而多有报道。其中DQ位点与扩张性心肌症［1］，病毒性乙型肝炎［2］，糖尿病［3，4］，银屑病［5］等多种疾病的罹患率及预后相关。1996年，HLA-DQ也被定义为移植抗原［6］。
目前，HLA分型有血清学分型和基因分型，后者更具优势和前途。对基因分型国际上推荐使用PCR-SSP和PCR-SSOP方法，但两者在设计或操作上略显繁琐。基因芯片的问世为HLA分型工作提供了新的思路，基因芯片的高通量、集成化和并行检测等优势使其极为适用于复杂的HLA遗传系统。国内外在这方面的报道很多，但尚没有成熟的分型产品问世，也未见临床大规模应用的报道。本研究使用自行构建的寡核苷酸芯片（oligonucleotide microarrays），对HLA-DQA1位点进行基因分型检测，旨在建立一套成熟的分型技术，用于复杂的HLA系统的分型研究。
材料和方法
DNA样本
50例临床样本采自医科大学附属第一，50例标准DNA样品由中国刑警学院法医系法医学教研室提供［7］。
主要试剂及仪器
手臂分子氨基丙基三乙氧基硅烷 (APTES)(Sigma公司)，PCR试剂盒及相关试剂(Promega公司)，鲑鱼精DNA（Sigma公司），其他化学试剂均为分析纯。PCR扩增仪（Biometra Personal PCR system，USA），生物芯片点样仪(MGⅡ600，BioRobotics，England)，激光共聚焦扫描仪(Gene TACTM LS IV，Genomic Solutions Inc. USA)
引物及探针
根据GenBank数据库新近公布的HLA- DQA1等位基因序列，在多态性集中的exon 2保守区及变异区分别设计1对引物及16条特异性分型探针，交由上海生物工程公司合成，并在正义链引物5’ 端作FITC标记，序列如下： P1(+)Exon2: 5’-TGTATT ACATGGGAATATGTGATTTTAGA-3’；P2(-)Exon2: 5’-CAGGGGTTGGAAATGTCCAC-3’，并在各探针5’ 端做氨基修饰。各组探针的序列见附表。
全血基因组DNA的提取
改良的酚/氯仿法: 1 ml抗凝的外周血，896×g离心5分钟，分离中层白细胞后，传统酚/氯仿/异丙醇法［8］抽提DNA，-20℃保存。
PCR扩增与产物标记
扩增体系20 μl，含基因组DNA 1 μl。以组间特异性引物，行1∶20不对称扩增。扩增条件96℃ 5分钟，96℃ 30秒，59℃ 40秒，72℃ 40秒，35个循环。产物以聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测。
载片制备
本室自建流程。市售玻片（20 mm×20 mm）于铬酸溶液中浸泡12小时以上，蒸馏水洗净，1N NaOH浸泡1小时，丙酮化3分钟。浸入手臂分子溶液（2%氨基丙基三乙氧基硅烷，以95%丙酮溶解）10分钟，丙酮清洗，104℃烤干后，5%戊二醛中浸泡过夜。
寡核苷酸微阵列的制备
以预先摸索好的条件，将16条寡核苷酸探针以探针缓冲液重悬至80 μmol/L，与同等浓度的阳性对照探针（全序列匹配的反义链引物）、阴性对照无关探针（与目标序列同源性低于50%）、空白对照探针缓冲液，共同加入384孔板。启动生物芯片点样仪，制成预先设计好的微阵列。点样中注意保湿，点样后37℃水化过夜，80℃烤干，备用。Table. Probe sequences (略)
封闭与核酸杂交
按本室方法［9］。取制备好的寡核苷酸芯片，用前以0.1% SDS洗去多余的未共价结合的探针。浸入5﹪二乙胺（0.01 MPB，pH=9），室温封闭30分钟，充分洗净吹干。PCR产物加杂交液（鲑鱼精DNA 10 μg/ml）按1∶1稀释混匀，取8 μl覆盖于各微阵列，加放硅烷化盖片。置入湿度适宜的杂交舱中55℃保温30秒。
洗涤与检测分析
取出杂交芯片，冲去盖片。用预热至60℃的洗液(1×SSC/0.1% SDS，0.5×SSC/0.1% SDS，0.1×SSC) 行梯度洗涤，用ddH2O洗净，吹干。使用激光共聚焦扫描仪检测，CCD成像软件分析杂交信号，确定样本的基因型。
结 果
基因组DNA的获取及靶基因的扩增
基因组DNA的浓度为100-200 ng/μl。A260/280值1?67-2.05，纯度均>50﹪。PCR产物经PAGE检测，可见扩增条带清晰，特异性理想，对称产物长度538 bp，与设计相符。
寡核苷酸芯片的分型
100份样品分型全部成功。其中50份标准样品分型结果与其模板全部相符。另50份临床血样随机抽取10份进行PCR产物测序，2份分型结果不完全相符(测序确定其为复合型，分别为0301/04，04/06；基因芯片分型为单纯型，即0301，04)，另8例正确。图A，B，C示1例选择测序的临床样本。
分型结果的稳定性
为验证芯片的稳定性及重现率，随机选取10份样品重复5次杂交实验。16个分型位点中，2份样品完全重复，3份可重复15个分型位点，5份重复14个分型位点。重现率95%。
讨 论
HLA复合体遗传区位于6P21.31，长约3 600 kb，约占人类基因组总长度的1/3 000。第十三届国际组织相容性专题会议确定已发现的HLA等位基因达到1 340个。HLA血清学分型多用微量淋巴细胞毒实验，在20世纪80年代中期之前是HLA研究的重点，其检查Ⅰ类抗原有效，但在检测Ⅱ类抗原时却遇到了困难：一方面Ⅱ类抗原在未激活T细胞上不表达，需分离纯化B细胞；另一方面Ⅱ类抗原多由双座位等位基因构成复杂的多态性，使得准确判定相应等位基因产物的抗原特异性十分困难。Opelz等［10］曾将来自58个移植中心的4 000份冰冻组织标本进行回顾性分析，发现血清学方法分型HLA-A、HLA-B错误率4%-9.2%，而HLA-DR分型错误率高达25%。因此Ⅱ类抗原多不采用血清学分型。目前，HLA基因分型国际上推荐使用PCR-SSP和PCR-SSOP。Bunce等［11］用188个引物，经144次PCR建立一步法PCR-SSP，成功地对HLA-Ⅰ、Ⅱ类所有抗原进行了分型。该方法特异性较高，但主要依赖于PCR技术，操作略显繁琐，且结果分析非常复杂。PCR-SSOP因具有灵敏度高、误差率小、样本量少的优点，是现今国内外分型应用最多的方法。但该法选择的支持介质是膜［12］或微滴定板［13］，对于HLA复杂的等位基因，不具有集成化的优势。基因芯片作为“20世纪影响最为深远的技术手段之一”，非常适合分型复杂的HLA系统，已引起众多科研机构的关注。但各家在制作分型芯片时方法差别相当大，表明基因芯片的技术流程还需要标准化。
国际上对实质性器官移植通用“六抗原无错配”标准，即HLA-A、-B、-DR在供受者中无错配，记为“0AgMM”［14］。而HLA-DQA1，-DQB1及-DRB1的连锁不平衡导致在限定人群中产生预期的抗原系。如大多白种人供受HLA- A、-B、-DRB1匹配者，HLA-DQB1及HLA- DQA1也同样匹配［15］。本研究所采用的HLA-DQA1位点的探针组合，尚属中等分辨率检测，若进行高分辨率检测，还需要设计更多的探针及进行探针的优化。而HLA基因分型的要求则视用途而定，就临床实质性组织器官移植而言，采用中分辨率的分型条件是最佳选择。因高分辨度将增加分型所需的时间和费用，且不易寻找到匹配的供者。但法医学上的个人鉴定则不同，确定唯一的等位基因型是其目的。本室研制的寡核苷酸芯片制作相对简单，易于操作，且稳定性好，特异性和灵敏度都能满足基因分型的需要，故适合器官移植前的组织配型及疾病相关基因型检测等临床应用。
在多次实验中，体会到探针连接，即水化的步骤至关重要，它对实验结果影响很大。水化过程中应注意保湿，且湿盒内要保持合适的盐溶液浓度。另外，杂交信号的强度与PCR扩增后的电泳条带似无明显相关。当某些原因造成PCR产量不足，或扩增条带特异性不理想时，对杂交信号强度及特异性并无明显影响。这在理论上一方面归因于碱基之间严格的互补配对，另一方面归因于芯片通过二级放大获得的高灵敏度。同时，有效而适宜的背景封闭可降低背景亮度，间接提高信噪比。
【】
1Liu W，Li WM，Sun NL. Relationship between HLA-DQA1 polymorphism and genetic susceptibility to idiopathic dilated cardiomyopathy. Chin Med J，2004；117:1449-1452
2Zang GQ，Xi M，Feng ML，et al. Curative effects of interferon-α and HLA-DRB1—DQA1 and -DQB1 alleles in chronic viral hepatitis B. World J Gastroenterol，2004；10: 2116-2118
3罗佐杰，粱杏欢，粱敏等. HLA-DQA1基因与广西地区壮族、汉族2型糖尿病关联性研究.中华内分泌代谢杂志，2004；20:425-427
4张冬梅，周智广，张弛等. 应用HLA-DQ基因型对自身抗体阴性1型糖尿病的再分型.中华内科杂志，2004；43:174-178
5Zheng GY，Wei SC，Shi TL，et al. Association between alcohol，smoking and HLA-DQAI*0201 genotype in psoriasis. Acta Biochimica Biophys Sin，2004；36:597-602
6Petersdorf EW，Longton GM，Anasetti C，et al. Definition of HLA-DQ as a transplantation antigen. Proc Natl Acad Sci USA，1996；93: 15358-15363
7张璐，李树，巴华杰等. 五个民族HLA-DQA的PCR多态性.中国刑警学院学报，2004；4:50-51
8Kramvis A，Bukofzer S，Kew MC.Comparison of hepatitis B virus DNA extractions from serum by the QIAamp blood kit，GeneRelea-ser，and the phenol-chloroform method. J Clin Microbiol，1996；34: 2731-2733
9何群，赵雨杰. 一种新的DNA芯片的封闭方法.遗传，2004；26:361-363
10Opelz G，Mytilineos J，Scherer S，et al. Survival of DNA HLA-DR typed and matched cadaver kidney transplants. Lancet，1991；38(8765):461-463
11Bunce M，O’ Neill CM，Barnardo MC，et al. Phototyping: comprehensive DNA typing for HLA-A，B，C，DRB1，DRB3，DRB4，DRB5 and DQB1 by PCR with 144 primer mixes utilizing sequence-specific primers (PCR-SSP). Tissue Antigens，1995；46:355-367
12Hurley CK，Maiers M，Ng J，et al. Large- scale DNA-based typing of HLA-A and HLA-B at low resolution is highly accurate，specific，and reliable. Tissue Antigens，2000；55:352-358
13Erlich HA，Sheldon EL，Horn G. HLA typing using DNA probes. Biotechnology，1990；4: 975-98
14Keever-Taylor CA，Bredeson C，Loberiza FR，et al. Analysis of risk factors for the development of GVHD after T cell-depleted allogeneic BMT: effect of HLA disparity，ABO incompatibility，and method of T-cell depletion. Biology of Blood and Marrow Transplantation，2001；7:620-630
15Imanishi.T.，Akaza.T.，Kimura.A.，et al. In HLA 1991.Oxford: Oxford Univ Press，1992: 1174-1178
