四色流式细胞术分析骨髓增生异常综合征原始细胞免疫表型
作者：吴雨洁，李建勇，仇海荣，肖冰，张建富，宋君红
【摘要】 为了研究骨髓增生异常综合征（MDS）患者骨髓原始细胞免疫表型特征，应用四色流式细胞术对常规设门及二次设门策略选取的29例MDS患者的骨髓细胞悬液中，CD34+细胞进行免疫表型分析。结果表明： ①随着MDS的进展（RA/RAS→RAEB→RAEB-T），根据CD45/SSC图中选取的原始细胞群中，CD34+细胞比例逐渐增高，分别为8.0%、46.4%、76.8%，各亚型之间差别有显著意义（P<0.05）。②在CD45 vs SSC散点图上，设门所取的原始细胞抗原表达随着RA/RAS→RAEB→RAEBT的进展，HLA-DR、CD13、CD33、CD117表达逐渐增高，CD15表达逐渐减低，差别均有显著意义（P<0.05）。③在CD45 vs CD34散点图上二次设门取CD34+原始细胞行抗原表达的分析，同样异常表达HLA-DR及髓系抗原CD13、CD33和CD117，比例高于常规分析法（P<0.05），CD15比例减低，在RA/RAS中CD13、CD33、CD117和HLA-DR的表达较常规分析的原始细胞比例明显增高（P<0.05），相关抗原的表达率在各亚型间差别无显著意义（P>0.05）。结论：常规设门法能反映MDS疾病的进展，而二次设门策略则更能反映MDS原始细胞的生物学特征，CD34的异常表达代表原始细胞的不成熟性和异质性，在临床高度怀疑但形态学和细胞遗传学不能诊断时，原始细胞免疫分型对MDS的诊断更具意义。
【关键词】 骨髓增生异常综合征
Four-color Flow Cytometric Immunophenotypic Features of Blasts in Myelodysplastic Syndromes
AbstractThis study was aimed at exploring the immunophenotypic features of blasts in patients with myelodysplastic syndromes (MDS). Four-color flow cytometry using conventional and secondary gating strategies was used to immunophenotype blasts and the CD34 positive cells in bone marrow nucleated cells of 29 patients with MDS. The results showed: (1) with progression of MDS from RA/RAS，RAEB to RAEB-T，the proportion of CD34+ cells were gradually increased from 8.0%，46.4% to 76.8% (P<0.05)；(2) using CD45 vs SSC gating strategy，with the transformation of RA/RAS，RAEB to RAEB-T，the expression of HLA-DR，CD13，CD33，CD117 were also gradually increased (P<0.05)，and the expression of CD15 was gradually decreased (P<0.05)；(3) using CD45 vs CD34 gating strategy，the expression of HLA-DR，CD13，CD33，CD117 on blasts were higher by secondary gating method than those by conventional gating (P<0.05). However，there were no significant difference (P>0.05) in the expression of above-mentioned antigens on CD34+ cells among different MDS subtypes. It is concluded that conventional gating method can reflect MDS progression from RA/RAS，RAEB to RAEB-T，and secondary gating strategy may accurately reflect the biological features of blasts in MDS. Abnormal expression of CD34 is related to the immaturity level and heterogeneity of blast cells，which is beneficial to the diagnosis of clinically suspected MDS incapable of diagnosing with morphology and cytogenetics.
Key words myelodysplastic syndrome；immunophenotype；four-color flow cytometry；CD34+ cell
骨髓增生异常综合征（MDS）是一组起源于造血干/祖细胞的恶性克隆性疾病，以外周血一系或多系细胞减少，骨髓一系或多系病态造血和高风险进展成急性髓细胞白血病为特征。我们应用一组单克隆抗体、四色六参数流式细胞术和常规和/或二次设门策略提取原始细胞、CD34阳性（CD34+）细胞，对其进行了免疫表型分析，以期为临床提供合理的诊断和依据。
材料和方法
病例选择
29例MDS患者，男17例，女12例，年龄20-71岁，其中RA/RAS 17例、RAEB 6例和RAEB-T 6例。MDS的诊断参照《血液病诊断与疗效标准》（张之南，第2版）。
材料
单克隆抗体包括HLA-DR-FITC、CD15-FITC、CD2-FITC、CD10-FITC、CD20-FITC、CD33-PE、CD13-PE、CD7-PE、CD19-PE、CD117-PE、CD34-ECD和CD45-PY5等及其相应的标记荧光素的同型对照，所有单克隆抗体均为法国Immunotech公司产品。流式细胞仪为Beckman-Coulter公司的Epics XL 型，采用Expo32-ADC分析软件。
骨髓原始细胞的表达
对29例MDS患者同时进行了形态学及免疫分型检测，其中26例(89.7%)形态学诊断为MDS，此26例骨髓原始细胞在形态学上和流式细胞术上所占百分比见表1，两者无统计学差异（P>0.05）。余3例（10.3%）形态学无法诊断的患者免疫分型均提示为RA/RAS。Table 1. Correlation between analysis of flow cytometry and morphology in 26 cases（略）
流式细胞术检测
新鲜抽取的肝素抗凝骨髓（6小时内），调整细胞数至（0.5-1）×106/ml，分6管标记抗体后，行流式细胞术分析测定。6管抗体组合分别为CD15/CD33/CD34/CD45、HLA-DR/CD13/CD34/CD45、CD2/CD7/CD34/CD45、CD10/CD19/CD34/CD45、CD20/CD117/CD34/CD45及阴性对照管IgG1-FITC/IgG1-PE/IgG1-ECD/CD45-PC5。
常规的分析方法
在CD45 vs SSC散点图上，至少分析10 000个细胞，取常规原始细胞的位置设A门后对A门细胞行不同抗原表达的分析（图1）。
二次设门分析方法
T门为在CD34直方图上对A门原始细胞上行二次设门取得的CD34+原始细胞群，对T门细胞行不同抗原表达的分析（图2）。
结果判定
抗原表达结果为各标本管抗原表达率减去阴性对照管自发荧光表达率。CD34>5%，髓系、淋系抗原>20%为阳性。
统计学处理t检验。
结 果
免疫表型表达
29例MDS各种抗原表达结果见表2和表3。表2显示常规方法直接对原始细胞设门后的表达结果，表3显示二次设门后各种抗原在CD34+原始细胞上的表达结果。
CD34在原始细胞中的表达
随着RA/RAS→RAEB→RAEB-T的进展，CD34+细胞比例逐渐增高，分别为8.0%、46.4%和76.8%，各亚型之间差别有显著意义（P<0.05）
两种分析方法抗原表达
检测结果显示，两种分析方法均异常表达HLA-DR及髓系抗原，不表达淋系相关抗原。常规获取的原始细胞随着RA/RAS→RAEB→RAEB-T的进展，HLA-DR、CD13、CD33和CD117表达逐渐增高，CD15表达逐渐减低，差别均有显著意义（P<0.05）。二次设门提取CD34+原始细胞同样异常表达HLA-DR及髓系抗原CD13、CD33和CD117，比例较常规分析结果增高，尤其在RA/RAS中，CD13、CD33、CD117和HLA-DR的表达率分别为87%、65.6%、56.6%和44.2%（表3），显著高于常规分析的原始细胞比例的51.6%、37.6%、17.1%及23.3%（表2）（P<0.05），但上述抗原的表达率在MDS各亚型间差别无显著意义（P>0.05）。Table 2. Immunophenotypic features of blasts in MDS（略）Table 3. Immunophenotypic features of CD34 positive cells in MDS（略）
讨论
MDS具有高度的异质性，病变过程涉及多个基因及经历多个复杂阶段。根据最新的世界卫生组织(WHO)分型标准，已将其列为髓系造血系统恶性肿瘤的一种［1］。为了更好地和国外相关进行对比，客观反映MDS的生物学特征与临床的相关性，我们沿用了FAB的分型标准，将MDS分为RA/RAS 、RAEB 和RAEB-T。结果显示，虽然原始细胞在形态学所占百分比略高于流式细胞分析结果，但无统计学差异（P>0.05），考虑为流式检测中溶血及少量细胞碎片所致，CD34在流式细胞术检测中的表达与文献一致［2-5］，早期干/祖细胞抗原CD34的异常表达与MDS的进展有关，29例MDS随着RA/RAS→RAEB→RAEBT的进展，CD34+细胞比例进行性增高，分别为8.0%、46.4%、76.8%，证明了在早期MDS阶段，恶性克隆性CD34+原始细胞已经存在，MDS的进展过程就是恶性克隆呈现优势性生长扩增的过程。
MDS原始细胞特征性地表达CD34+ HLA-DR+CD13+CD33+［4］。文献所分析的原始细胞均常规选取低SSC且CD45弱表达的原始细胞区域［2，4-6］，但实际这一部位包含了正常及异常原始细胞，所得结果缺乏标准性。我们利用的CD34+细胞在正常骨髓中<1.1%［7］，但在MDS中异常增高，并以文献未见报道的二次设门法，提取CD34+的原始细胞，这样能更为客观地进行不同抗原表达的分析，并与常规的分析方法进行了比较，因此得出了与常规设门不同的结果，即CD34+原始细胞虽然表达HLA-DR+及髓系相关标记CD13+CD33+CD117+，但各标记在各亚型之间的差别并无显著意义（P>0.05）。我们认为，随着MDS由低危向高危的进展，正常的原始细胞随着异常的原始细胞数逐渐增高，比例将呈相对的减少，尤其在RA/RAS中，异常原始细胞比例低，难以形成独立的细胞群体，按常规分析的结果很难反映MDS的异质性和恶性克隆的真正表型特征。
许多学者［2，4-6］采用常规的分析方法后，得出部分抗原表达随着CD34的增高出现相应异常变化这一结论（HLA-DR、CD13、CD33和CD117表达逐渐增高，而CD15表达则逐渐降低），由此认为与病情进展和预后有关，而经过二次设门所分析的结果表明，抗原表达的异常并没有随MDS的进展而发生明显变化（P>0.05），即单纯凭借抗原表达不能对病情预后和效果的预示提供帮助。我们认为，CD34的增高虽与MDS的进展有关，但这只是反映优势恶性克隆数量上的增加，而不能真正触及疾病的进展本质。
虽然细胞形态学和细胞遗传学一直是诊断MDS的金标准，但在实际细胞分类工作中会由于病态造血类型多且缺乏公认的量化标准以致易于忽略，而文献报道异常染色体核型的检出率也仅为40%-70%［8］。在我们检测的29例病例中有3例（10.3%）形态学无法诊断，22例（75.9%）细胞遗传学无法提示。而流式细胞术具有高度的敏感性，可以检测到>10-4的早期恶性克隆，从而更广泛地捕获异常细胞，尤其对全血细胞减少及骨髓纤维化的样本，流式细胞术较细胞形态学更能显示其独特的优势。
Maynadie等［5］分析了207例MDS患者和68例正常对照骨髓样品中原始细胞的免疫表型，结果MDS原始细胞高表达CD34及 CD36，而正常对照原始细胞低或不表达CD34及CD36，他们认为MDS中CD34的异常表达代表原始细胞的不成熟性和异质性。我们同意Kristensen等［9］观点，在临床高度怀疑但形态学和遗传学不能诊断时，免疫表型将作为MDS（特别是RA）的重要诊断指标，因此当骨髓CD34+细胞≥1.5%，免疫表型检测结果对MDS的诊断更具意义。
【文献】
1Harris NL，Jaffe ES，Diebold J，et al. The World Health Organization classification of neoplastic diseases of the haematopoietic and lymphoid tissues: report of the Clinical Advisory Committee Mee-ting， Airlie House，Virginia November 1997. Histopathology，2000；36：69-87
2Baur AS，Meuge-Moraw C，Schmidt PM，et al. CD34/QBEND10 immunostaining in bone marrow biopsies: an additional parameter for the diagnosis and classification of myelodysplastic syndromes. Eur J Haematol，2000；64：71-79
3陈桂彬，邵宗鸿，张益枝等．骨髓增生异常综合征免疫表型的研究．中华血液学杂志，1999；20:14-16
4Ogata K，Nakamura K，Yokose N，et al. Clinical significance of phenotypic features of blasts in patients with myelodysplastic syndrome. Blood，2002；100： 3887-3896
5Maynadie M，Picard F，Husson B，et al. Immunophenotypic clustering of myelodysplastic syndrome. Blood，2002；100：2349-2356
6Xu D，Schultz C，Akker Y，et al. Evidence for expression of early myeloid antigens in mature，non-blast myeloid cells in myelodysplasia. Am J Hematol，2003；74：9-16
7Krbling M，Anderlini P. Peripheral blood stem cell versus bone marrow allotransplantation: does the source of hematopoietic stem cells matter? Blood，2001；98：2900-2908
8Stetle-Stevenson M，Arthur DC，Jabbour N，et al. Diagnostic utility of flow cytometric immunophenotyping in myelodysplastic syndrome. Blood，2001；98：979-987
9Kristensen JS，Hokland P. Monoclonal antibody ratios in malignant myeloid diseases:diagnostic and prognostic use in myelodysplastic syndromes. Br J Haematol，1990；74：270-276
