细胞因子体外诱导慢性髓细胞性白血病树突状细胞分化的研究
作者：张玉芳，吴重阳，张连生，柴晔
【摘要】 本研究探讨干扰素（IFN）慢性粒细胞性白血病（CML）的可能新机制，为临床治疗CML提供新的思路。用Ficoll密度离心法分离骨髓单个核细胞(BMMNC)，用不同细胞因子组合体外诱导培养树突状细胞（DC），在倒置显微镜及光镜下观察DC形态，应用流式细胞术检测其表面标志（CD1a，CD83，CD86，HLA-ABC，HLA-DR，CD54），MTT法检测其混合淋巴细胞反应（MLR）能力。结果表明：经不同细胞因子组合所诱导出的DC，其特征性表面分子表达率均高于培养前的DC（P<0.01）；IFN-α+GM-CSF组DC表达HLA-ABC、HLA-DR明显高于IL-4+GM-CSF培养组（P<0.05）；而IFN-α+GM-CSF+IL-4组DC的CD86表达率及MLR水平均高于其它细胞因子组合组（P<0.05）。干扰素耐药组DC表面分子表达率及MLR水平较新诊断组和干扰素治疗有效组均明显减低（P<0.05），但A、B、C各组的CD86表达率及MLR水平在IFN-α+GM-CSF+IL-4因子组合条件下无明显差异。结论： CML骨髓单个核细胞在含有IFN-α的细胞因子组合条件下可分化为具有形态和免疫表型特征的DC，且表达较高的I类和II类分子、共刺激分子、黏附分子及MLR，表明干扰素治疗CML的机理可能与DC有关，这一结果提示通过增强内源性DC功能可能提高CML 临床疗效。
【关键词】 慢性髓细胞性白血病
In Vitro Cytokines-Induced Differentiation in Mononuclear Cell Derived Dendritic Cells from Chronic Myeloid Leukemia
0. Abstract The purpose of this study was to investigate the mechanism of effects of interferon-alpha (IFN-α) on chronic myeloid leukemia (CML). Bone marrow mononuclear cells（BMMNC） were obtained from heparinized blood of CML patients by Ficoll-Paque density gradient centrifugation. The expressions of CD1a，CD83，CD86，HLA-ABC，HLA-DR and CD54 on DC induced by IFN-α+GM-CSF，IFN-α+GM-CSF+IL-4 and IL-4+GM-CSF for 7 days in vitro were assayed by flow cytometry. The morphologic features were observed by transmission and optical microscopy. The mixed lymphocyte reactions (MLR) with DC were evaluated by MTT assay. The results showed that the DC cultured in different cytokine combinations expressed significantly higher levels of CD1a，HLA-ABC，HLA-DR，CD86，CD54，and CD83 than those in the precultured. The DC growing with IFN-α+GM-CSF expressed significantly higher levels of HLA-ABC，HLA-DR than those in GM-CSF+IL-4. The CD86 expression and MLR levels in IFN-α+GM-CSF+IL-4 increased significantly. The expression rate of DC antigens and MLR in the IFN resistant group significantly lower than those in the newly diagnosed and the effectively treated groups after at least 6 months of IFN-α treatment (P<0.05) . The DC from the IFN resistant group did not express significantly CD86 and MLR in IFN-α+GM-CSF+IL-4 groups compared to those in the newly diagnosed and IFN effective treated groups. It is concluded that the BMMNC from CML cultured in combination with IFN-α and other cytokines can be induced into DC with typical morphologic and immunophenotypic characteristics. Addition of IFN-α+GM-CSF+IL-4 to DC cultures can significantly up-regulate the expression of major histocompatibility complex molecules，co-stimulatory molecules and various adhesion molecules. The deficiency of DC differentiation and function may play a role in the development of clinical resistance to IFN-α.
Key words chronic myeloid leukemia；IFN-α；dendritic cell；cytokine
树突状细胞（dendritic cell，DC）是激活初始型T细胞和维持细胞免疫反应最重要的抗原呈递细胞（antigen-presenting cell，APC），其功能是通过表达大量的I、II类人白细胞分化抗原(human leukocyte antigen，HLA-I、II)分子、共刺激分子及黏附分子而实现的。干扰素（interferon-α，IFN-α）是目前治疗慢性粒细胞性白血病（chronic myeloid leukemia，CML）的首选药物，能部分消除Ph1染色体阳性细胞，推迟急变的发生［1，2］，但机理尚未完全明了。我们试图从IFN-α 诱导CML特异性DC产生的角度解释其治疗CML的机理，为临床治疗CML提供新的思路。
材料和方法
研究对象及分组
选取我院经骨髓及染色体检查确诊为CML的患者20例，分为A、B、C 3组，其中A组9例，为新诊断而未治疗的患者（Ph1染色体阳性率为100%）；B组6例，为干扰素治疗6个月后达到部分细胞遗传学缓解患者（Ph1染色体阳性率小于95%）；C组5例，为干扰素治疗6个月后无细胞遗传学缓解的患者（Ph1染色体阳性率大于95%）。
DC的体外定向诱导分化及形态观察
采集患者骨髓液3 ml（已治疗者于停药半月后采集），肝素（40 U /ml）抗凝，用37℃的PBS液2倍稀释。取20 ml玻璃离心管，加淋巴细胞分离液后将上述已稀释的抗凝骨髓液沿管壁轻轻加在淋巴细胞分离液面上，使体积比为3∶2，1500rpm离心20分钟，由上至下可分4层：血清、单个核细胞（BMMNC）、淋巴细胞分离液、红细胞。收集BMMNC置于10 ml离心管中，用PBS稀释，分别以1500、1000、800 rpm各离心10分钟，3次，洗净血小板后记数。参照Romani 等［3］分离培养DC的方法，以无血清RPMI 1640培养液悬浮沉淀细胞，调整细胞浓度到（3-5）×106/ml 后接种于培养瓶中，在37℃、5% CO2孵箱中温育2小时；轻轻吸出未贴壁细胞，贴壁细胞继续培养16-24小时后，收集悬浮细胞并记数。用完全RPMI 1640培养液调整细胞浓度到（3-5）×106/ml后接种于24孔板中，同时加入不同配伍组合的细胞因子： ① IFN-α+GM-CSF，② IL-4+GM-CSF，③ IFN-α+GM-CSF+IL-4 (IFN-α、GM-CSF均为1 000 U/ml，IL-4为500 U/ml)，置37℃、5% CO2孵箱中培养，第3-4天补充半量新鲜培养液及半量浓度的细胞因子。在细胞培养过程中用相差显微镜动态观察DC细胞形态并摄像。第7天用细胞悬液涂片，瑞氏-吉姆萨染色，光镜观察并摄像。
DC免疫表型检测
采用流式细胞仪（fluorescence-activated cell sorter，FACS）直接免疫荧光标记法检测。在DC培养的第7天收集细胞，调整浓度为1×106/ml，取细胞悬液100 μl/tube，分别加入用FITC-标记的CD1a、CD83、HLA-DR、CD86 、HLA-I及CD54单克隆抗体10 μl直接染色；混匀后置室温下暗室反应15分钟，加PBS液1000rpm 离心5分钟，离心洗涤后，以1%多聚甲醛固定，流式细胞仪检测，每份样本检测10 000个细胞，用Cell Quest软件阳性细胞比率。
DC功能检测（MLR）
取培养第7天的DC用完全培养液悬浮，加入终浓度为25 mg/L的丝裂霉素C（MMC），37℃孵育45分钟，加PBS液1500r/min离心5分钟，洗涤3次，调整细胞浓度；取正常骨髓血，分离单个核细胞，37℃培养2小时后取悬浮细胞用作同种异体T细胞，调整浓度为2×105个／ 100 μl，每孔100 μl；然后按DC∶T细胞分别为1∶50、1∶100、1∶200、1∶500接种在24孔圆底培养板，终体积为200 μl/well，并设3个复孔，37℃、5% CO2条件下培养96小时；沉淀细胞，吸出上清，加入MTT液（5 mg/ml）20 μl；另设2个空白孔加入MTT 20 μl作为对照，继续培养4-6小时；去上清液后每孔均加入二甲亚砜（DMSO）150 μl，振荡10分钟，待结晶的MTT充分溶解后以空白孔调零，酶联仪检测波长550 nm时各孔吸光度（A值），结果取平均值。
统计分析
采用SPSS 8.0软件，各组内及组间相同指标进行方差分析，所测数据用均数±标准差（x±SD）表示，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异非常显著。
结果
DC的形态观察
新分离的CML患者BMMNC呈球形散在分布，表面光滑；加入细胞因子组合培养48小时后，高倍倒置显微镜下可见部分细胞悬浮并发生聚集样增生；培养3天后，大部分细胞均已悬浮，聚集样细胞群变大并可见明显的多形性，形状由开始时的圆形变成轻度不规则形，部分细胞可见有树突状突起；培养7天后细胞均匀分散，进一步变形，体积增大，胞浆丰富，具有树突状突起的细胞增多且突起更为明显(图1A)；同时将培养7天获得的细胞悬液涂片，瑞氏-姬姆萨染色观察可见细胞膜有明显的刺样突起，核偏在且不规则，部分含有偏心的双核（图1B）。
树突状细胞免疫表型
结果见附表。A、B、C 3组组内比较表明： DC经不同细胞因子组合培养后，表面分子CD1a、CD83、CD86、HLA-DR、HLA-ABC、CD54的表达均高于培养前，差异显著（P<0.01）；IFN-α+GM-CSF培养组DC表面HLA-ABC、HLA-DR的表达高于IL-4+GM-CSF组，差异具有显著性（P<0.05）；IFN-α+GM-CSF+IL-4组合培养后DC表面CD86的表达明显高于IFN-α+GM-CSF及IL-4+GM-CSF组（P<0?05）。Table . Positive rates of surface antigens on DC induced by different cytokine combinations in vitro（略）
A、B、C各组间比较表明：所有表面分子表达率在培养前C组低于A及B组，但各组间无明显差异。经2种因子组合培养后，表面分子表达率在C组明显低于A及B组，差异具有显著性（P<0.05），而用IFN-α+ GM-CSF+IL-4组合培养的DC，其CD86的表达率在3组间无明显差异，而其余表面分子表达率差异显著。
MLR结果
A、B、C 3组内用IFN-α+GM-CSF+IL-4组合培养的DC，吸光度值高于其他因子组合组，差异显著（P<0.05）。 3组间比较，经2种细胞因子组合培养后，C组的吸光度值低于A、B两组，差异显著（P<0.05）（图2），但3种细胞因子组合培养后，C组的吸光度值略低于A、B两组，差异不显著（图3）。
讨 论
CML是一种在髓系造血祖细胞水平上发生的恶性肿瘤，具有特征性的因t（9；22）易位形成的费城（Ph）染色体，含有bcr-abl嵌合基因，可表达具有增强酪氨酸激酶活性的P210bcr-abl蛋白，从而干扰细胞信号转导过程，阻碍细胞分化，抑制细胞凋亡，导致与t（9；22）易位相关的造血祖细胞克隆扩增［1］。CML目的是消除这种恶性细胞，较长时间维持慢性期，尽可能防止进入急性变期，但常用的羟基脲等不能使Ph1染色体阳性细胞转为阴性。目前针对Ph1染色体阳性细胞的治疗方法主要有以下三种：造血干细胞移植、干扰素应用及STI571疗法。
自20世纪80年代应用干扰素（IFN）治疗CML以来，发现它可使 70%-80%患者具有明显的血液学反应并呈现生存优势［1，2］，40%有细胞遗传学反应，5%-9%可获完全细胞遗传学反应。因此，对于年龄在50岁以上且无HLA匹配供者的CML患者，IFN已成为目前CML的一种标准的初治治疗措施，但其机理未完全明了。目前所知干扰素治疗CML 的主要机理是：调节骨髓祖细胞及基质细胞的黏附；调节细胞因子的释放；对白细胞克隆的选择性毒性作用；增强免疫调节；增强CML来源的DC的异质性及其T细胞刺激作用；调节细胞内信号转导蛋白质的磷酸化水平，诱导K562细胞S期积累；抑制抗凋亡基因及癌基因的表达等［4，5］。另外Cortes等［6］研究证实，GM-CSF联合IFN-α 治疗CML比单用IFN-α 更有效，但其机制尚待更进一步研究。关于干扰素诱导DC与CML疗效关系的研究少有报道。
DC是体内专职的抗原呈递细胞，在机体的免疫应答中的重要作用是通过表达大量的HLA-I、II类分子及共刺激分子和黏附分子实现的。而大多数血液系统的恶性肿瘤（CML、AML 、ALL、 MDS）因发生了编码B7基因的染色体同其他染色体的易位，使肿瘤细胞表面B7表达不足或缺陷，不能有效地呈递肿瘤相关抗原和激发T细胞产生有效的抗肿瘤免疫反应而致T细胞无能，使肿瘤细胞得以免疫逃逸［7，8］。在治疗上应用足够数量且功能正常的DC细胞越来越受到重视，目前利用转基因和细胞因子诱导等方法已成功地上调了DC细胞表面共刺激分子B7的表达［4，9］。
Chen 等［10］发现，CML的外周血单个核细胞经IFN-α+GM-CSF作用可培养出典型形态的DC，FISH分析示显其来源为白血病细胞。
本实验经IFN-α、IL-4 、GM-CSF等因子不同组合，从CML患者骨髓单个核细胞诱导培养出具有典型形态和免疫表型的DC，并发现IFN-α+GM-CSF因子组合培养的DC比经典方法（IL-4+GM-CSF）培养的DC更成熟（HLA-DR和HLA-ABC的表达更高），且用3种因子组合培养的DC的CD86表达及MLR水平明显增高，这与Wang等［4］，Paquette等［11］所得结果相近，说明IFN-α 治疗CML有效的机理可能是诱导了特异性DC的产生。对IFN-α治疗无效者，不同因子组合培养的DC表面各种分子的表达及MLR水平均低于新诊断者及对干扰素治疗有效者，说明DC分化成熟和功能缺陷在IFN-α的临床耐药中起一定作用，用3种细胞因子组合培养的DC表面CD86的表达及MLR水平亦较其他2种细胞因子组合明显增高，提示为提高CML患者DC分化成熟及功能，临床可应用IFNα 伍用其它细胞因子（如IL-4+GM-CSF）来治疗，为CML治疗获得更好的疗效，提供一个新的思路。
IFN-α+GM-CSF+IL-4组合培养的DC在A、B、C 3组病人都表现为共刺激分子（CD86）明显增高（P<0.05），这是否与其诱导基因易位恢复并逆转耐药有关？有待进一步研究。
【】
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11Paquette RL，Hsu N，Said J，et al. Interferon-alpha induces dendritic cell differentiation of CML mononuclear cells in vitro and in vivo. Leukemia，2002；16:1484-1489
