EPO对铁调节蛋白Hepcidin表达影响的研究
作者：孙雪峰，周道斌，赵永强
【摘要】 本研究探讨红细胞生成素（EPO）在正常小鼠、急性炎症小鼠和慢性病性贫血（ACD）小鼠模型中对hepcidin mRNA表达的影响。通过小鼠背部皮下双肩胛骨间脂肪垫内注射松节油的方法建立急性炎症模型和ACD模型。正常小鼠、急性炎症期小鼠和ACD小鼠腹腔注射EPO后用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）半定量法检测肝脏hepcidin mRNA的表达水平。结果显示，长期慢性炎症并未使小鼠肝脏hepcidin mRNA表达显著升高，但单次注射松节油可以使小鼠肝脏hepcidin mRNA水平一过性显著升高。腹腔注射EPO能够抑制正常小鼠、ACD小鼠与急性炎症小鼠肝脏hepcidin mRNA的表达。ACD小鼠在注射EPO后血红蛋白水平与肝脏hepcidin mRNA表达水平呈线性负相关。结论：皮下多次注射松节油可以建立ACD模型。在ACD发病过程早期肝脏hepcidin mRNA升高，在此之后恢复正常。EPO在正常条件、急性炎症条件和慢性炎症条件下均可抑制hepcidin mRNA的表达。
【关键词】 慢性病性贫血； hepcidin； 红细胞生成素； 铁代谢
An Iron Regulator Hepcidin Is Affected by EPO
Abstract To investigate the effect of EPO on hepcidin mRNA expression in normal mice，acute inflammatory mice and ACD mice，the acute phase model and ACD model of mouse was produced by subcutaneous injection of turpentine oil. Hepatic hepcidin mRNA expression levels of normal mice，acute inflammatory mice and ACD mice were detected by semi-quantitative retro-transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR) after intra-peritoneal injection of EPO. The results showed that prolonged chronic inflammation did not significantly increase mouse hepatic hepcidin mRNA expression，but a single injection of turpentine oil increased mouse hepatic hepcidin mRNA expression transiently. Intra-peritoneal injection of EPO down-regulated hepatic hepcidin mRNA expression in normal mice，ACD mice and acute inflammatory mice. Hb levels had a negative correlation with hepatic hepcidin mRNA expression levels in ACD mice treated with EPO. It is concluded that the ACD model can be produced by repeated subcutaneous injection of turpentine oil. Hepatic hepcidin mRNA expression increased during the early period of ACD process and then fall to normal level. EPO down-regulate hepcidin mRNA expression under the normal，acute inflammation and chronic inflammation conditions.
Key words anemia in chronic disease; hepcidin; erythropoietin; iron metabolism
Hepcidin是新近发现的一个由肝脏合成的小分子肽，它通过减少小肠对铁的吸收以及减少网状内皮系统对铁的释放负性调节铁代谢平衡，可能在铁代谢中起到核心调节作用。慢性病性贫血（anemia of chronic disease，ACD）是常见的临床综合症之一，多伴发于感染、关节炎、恶性肿瘤或者创伤等慢性疾病。临床发现，患有hepcidin大腺瘤的患者表现为与ACD相类似的贫血，而当腺瘤切除后，贫血可以自发恢复正常［1，2］。这表明hepcidin的过度表达可以引起贫血。肝脏合成hepcidin增多时的铁代谢异常与ACD中的铁代谢异常非常相似，提示hepcidin在ACD发病中可能起重要作用。EPO在临床上广泛应用于ACD的，但其作用机理始终未能完全明了。
本实验旨在通过检测急性炎症期小鼠与ACD小鼠hepcidin表达水平的变化情况，研究hepcidin与ACD发病之间的联系；同时通过观测EPO在正常条件、急性炎症条件以及ACD条件下对hepcidin影响程度的差异，试图解释EPO调节hepcidin可能的途径。
材料和方法
动物
C57BL/6N小鼠，雄性，6-7周龄，体重18-20 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于SPF环境。同批小鼠随机分组。
主要试剂及仪器
利血宝（rhEPO）由麒麟鲲鹏（）生物药业有限公司惠赠。RNA提取所用TRIZOL液及Superscript 逆转录试剂盒购自Invitrogen公司。PCR扩增引物由上海生工生物工程公司合成。Celltac全自动血液分析仪为Nihon Kohden产品，8800型凝胶成像分析系统为Alpha Innotech产品。
ACD模型的建立
小鼠经乙醚吸入麻醉后，在背部双肩胛骨之间脂肪垫内注射松节油（0.1 ml/20 g体重），每周1次，共注射4次，末次注射4周后（第8周）处死小鼠进行检测。对照组脂肪垫内注射等量生理盐水。
rhEPO对hepcidin的影响
腹腔注射rhEPO 50 U（用无菌生理盐水稀释成0.3 ml），每天1次，共3天，末次注射24小时后处死小鼠进行检测。小鼠摘眼球取血于肝素抗凝管中送检。用颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔，充分暴露肝组织，取肝脏左叶，去除大血管与表面的筋膜组织，将其剪成1 cm×1 cm大小的组织块，用DEPC水清洗后置于冻存管中，投入液氮中冷却后放入-80℃冰箱保存。用天平称量肝组织50-100 mg，置于装有1 ml TRIZOL液的1.5 ml Eppendorf管中，用剪刀将肝组织充分剪碎，剧烈振荡后静置5分钟。根据TRIZOL产品说明提取总RNA，使用Superscript 逆转录试剂盒合成cDNA，然后进行小鼠hepcidin-1与β-actin的PCR扩增，其引物序列分别为： hepcidin（hepc1）：（上游）5’-CCTATCTCCATCAACAGATG-3’与（下游）5’-AACAGATACCACACTGGGAA-3’；内参照β-actin：（上游）5’-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3’ 及（下游）5’-TTTGATGTCACGCACGATTT-3’。扩增条件为94℃ 20秒→50℃ 20秒→72℃ 20秒，共25个循环。PCR扩增产物电泳并拍照。采用Innotech附带凝胶图像分析系统进行分析。对照组腹腔注射等量生理盐水。
统计分析
所有数据处理均采用SPSS 11.5 for windows软件包，计量资料统计采用独立样本t检验（方差齐者用t检验，方差不齐者用校正t检验），双变量关系采用直线回归，方差分析检验。P<0.05为具有统计学意义。
结 果
小鼠ACD模型的建立
实验组小鼠在首次注射48小时后即可触摸到背部局部的肿块，1周时可看到隆起的肿块。在末次注射松节油4周后（第8周）取血进行血常规检测，Hb、RBC和HCT检测值均比对照组低，差异极其显著（P<0?01），而MCV与MCH与对照组无显著性差异（P>0.05），表现为正细胞正色素性贫血（附表）。Table . Comparison of complete blood count between ACD mice and control mice（略）
Hepcidin在急性炎症和ACD模型中的表达
给小鼠背部脂肪垫内注射1次松节油后，观察到hepcidin mRNA在注射后12小时开始升高，为正常小鼠的1.5倍；注射后16小时达到正常小鼠的4倍，之后逐渐下降，到注射后24小时基本已经恢复到正常水平；注射后48小时与72小时均未见肝脏hepcidin mRNA表达再升高(图1)。实验组慢性炎症小鼠在末次注射松节油1周后（第5周）以及4周后（第8周，此即为ACD模型）小鼠肝脏hepcidin mRNA表达水平均较对照组同龄正常小鼠高，但均无显著性差异（P>0.05）（图2）。
EPO对hepcidin mRNA表达的影响
给予正常小鼠、ACD小鼠腹腔注射rhEPO 50 U，每天1次，共3天，24小时后肝脏hepcidin mRNA水平与各自的对照组相比较均明显受到抑制，存在显著性差异（图3，图４）。与正常小鼠在使用rhEPO后肝脏hepcidin mRNA明显受到抑制相比，ACD小鼠在使用rhEPO后肝脏hepcidin mRNA被抑制的程度不尽相同，其Hb水平与hepcidin mRNA水平呈线性负相关（图５）。而预先注射rhEPO×3天，然后再皮下注射松节油的小鼠，其hepcidin mRNA的表达水平明显低于皮下注射松节油的小鼠，存在显著性差异（图6）。
讨 论
慢性病性贫血(ACD)是最常见的临床综合征之一，多伴发于感染、关节炎、恶性肿瘤或者创伤等慢性疾病。铁代谢异常被认为是与ACD发病关系最为密切的机理。曾经认为细胞因子的过度表达是导致ACD患者铁代谢异常的直接原因［3］，但随着对铁代谢过程的逐渐认识，在2000年从尿液和血浆超滤液中［4］提取出的一个由肝脏合成的具有抗微生物作用的小分子肽hepcidin获得了重视，越来越多的证据表明，hepcidin可以通过减少小肠对铁的吸收与网状内皮细胞对铁的释放来实现对铁代谢的负性调节。铁负载和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可以导致肝细胞hepcidin mRNA过度表达［5］，贫血、缺氧则使hepcidin mRNA的表达减少［6］，而炎症刺激可通过IL-6途径促进hepcidin mRNA的表达。由于hepcidin在铁代谢中的核心调节作用以及铁代谢异常在ACD发病中的重要性，许多人都认为，hepcidin在ACD发病机理中起到重要作用［7-10］。
本实验首先通过小鼠背部皮下双肩胛骨间脂肪垫内多次注射松节油的传统方法建立了ACD模型，并证明其为正细胞正色素性贫血，符合ACD的表现。
本实验的结果发现，在单次注射松节油后的急性炎症条件下，hepcidin曾经有一过性显著升高，这让我们相信hepcidin与炎症过程之间存在联系。而ACD小鼠hepcidin基因表达水平虽然略高于同龄正常小鼠，但并无显著性差异，说明ACD小鼠在初期的hepcidin升高之后很快恢复到了正常水平，并维持在正常水平。但也不能除外下述可能：即ACD小鼠hepcidin水平高于正常小鼠，只是因为本实验中所用半定量检测方法以及较小的样本数量未能将实验组与对照组的差异区分开来。这尚需要进一步增加样本量，并提高hepcidin的检测方法加以证实。
本实验证实，EPO在正常小鼠、急性炎症小鼠和ACD小鼠模型中均可抑制hepcidin的表达。与正常小鼠注射rhEPO后hepcidin mRNA全部明显受抑相比，ACD小鼠在注射rhEPO后hepcidin mRNA表达水平存在较大的个体差异，并与血Hb水平呈线性负相关。其原理尚不清楚，可能与ACD小鼠对于炎症刺激的不同免疫反应、不同的细胞因子浓度以及不同的hepcidin水平相关。有报道，rhEPO可以抑制正常小鼠肝脏hepcidin mRNA的表达［11］，其结果与本实验的对应部分基本相同。
临床上有时会遇到贫血患者使用rhEPO后的低反应性现象，以往认为一般与缺铁以及炎性细胞因子等相关，现已知hepcidin在铁代谢中起核心作用，而我们的实验也发现ACD小鼠注射rhEPO后Hb水平与hepcidin mRNA表达水平呈线性负相关，因而可以推测rhEPO的低反应性也许是由于hepcidin的高水平所致，但这尚需进一步的研究以证实。如果此推测成立，通过使用hepcidin抗体以拮抗hepcidin，一方面能够改善铁代谢，另一方面也能扭转rhEPO的低反应性，这对于贫血的将大有裨益。
【文献】
1 Weinstein DA，Roy CN，Fleming MD，et al. Inappropriate expression of hepcidin is associated with iron refractory anemia: implications for the anemia of chronic disease. Blood，2002；100: 3776-3781
2 Roy CN，Weinstein DA，Andrews NC. 2002 E. Mead Johnson Award for Research in Pediatrics Lecture: the molecular biology of the anemia of chronic disease: a hypothesis. Pediatr Res，2003； 53: 507-512
3 Means RT Jr. Pathogenesis of the anemia of chronic disease: a cytokine-mediated anemia. Stem Cells，1995； 13: 32-37
4 Krause A，Neitz S，Magert HJ，et al. LEAP-1，a novel highly disulfide-bonded human peptide，exhibits antimicrobial activity. FEBS Lett，2000； 480: 147-150
5 Pigeon C，Ilyin G，Courselaud B，et al. A new mouse liver-specific gene，encoding a protein homologous to human antimicrobial peptide hepcidin，is overexpressed during iron overload. J Biol Chem，2001； 276: 7811-7819
6 Nicolas G，Chauvet C，Viatte L，et al. The gene encoding the iron regulatory peptide hepcidin is regulated by anemia，hypoxia，and inflammation. J Clin Invest，2002；110: 1037-1044
7 Means RT. Hepcidin and cytokines in anaemia. Hematology，2004； 9: 357-362
8 Roy CN Andrews NC. Anemia of inflammation: the hepcidin link. Curr Opin Hematol，2005； 12: 107-111
9 Means RT Jr. Hepcidin and anaemia. Blood Rev，2004； 18: 219-225
10 Andrews NC. Anemia of inflammation: the cytokine-hepcidin link. J Clin Invest，2004； 113: 1251-1253
11 Nicolas G，Viatte L，Bennoun M，et al. Hepcidin，a new iron regulatory peptide. Blood Cells Mol Dis，2002； 29: 327-335.
