32例儿童非亲缘脐血移植临床研究
【摘要】 本研究对山东省脐血造血干细胞库2001年8月至2004年6月所提供32例儿童无血缘脐血移植（URCBT）进行回顾性分析，观察非血缘脐血造血干细胞移植(UCBT)的疗效及并发症。常规进行脐血的收集、分离、保存、检测、冻融和输注。用PCR-SSO、PCR-SSP、SBT技术检测HLA-A、B、DR。结果表明： 32例患血液系统疾病儿童，中位年龄8(2-15)岁；中位体重31.5(14-55)kg，其中急性淋巴细胞白血病(ALL)13例，均为高危型；急性髓系白血病(AML)9例，包括M1 1例，M2 4例，M4 3例，M5 1例；慢性髓系白血病(CML)2例；重型再生障碍性贫血(SAA)3例；急性混合性白血病(HAL)3例；非何杰金氏淋巴瘤2例。供受者ＨＬＡ全相合为10例，１个位点不相合为１6例，２个位点不相合为6例。供受者ＡＢＯ血型相合12例，不相合20例。输入有核细胞（ＴＮＣ）5.57（2.16-12.3）×107／kg，CD34+细胞1.78(0.85-5.92)×105/kg。采用以环磷酰胺（Cy）和全身照射（TBI）为主的Cy/TBI预处理方案４例，以白消安（Bu）和环磷酰胺（Cy）为主的Bu/Cy预处理方案２1例，其他方案预处理7例。GVHD预防采用以环孢菌素A为主的方案。结果表明： 32例患者20例（62.5％）白细胞达到植入标准，ANC≥0.5×109/L的中位时间17（9-38）天； Plt≥20×109/L 中位时间 42(18-102)天。Ⅱ-Ⅳ度和Ⅲ-Ⅳ度急性GVHD累计发生率分别为35%和15%。1年总生存率59.4%，2年总生存率40.6%。结论： HLA相合及1-2个位点不合异基因脐血造血干细胞移植是可行的，尤其在儿童血液病方面具有应用前景。
【关键词】 造血干细胞移植； 非亲缘脐血移植； 恶性血液病
Clinical Study of Unrelated Umbilical Cord Blood Transplantation in 32 Children Patients
Abstract To evaluate the clinical efficacy of unrelated umbilical cord blood transplantation (UCBT) on the treatment of children with hematologic malignancies and nonmalignancies，between August 2001 and June 2004，32 patients were transplanted by using unrelated umbilical cord blood supplied by Shandong Umbilical Cord Blood Bank. Out of them，13 patients suffered from ALL，9 from AML，3 from AA，3 from HAL，2 from CML and 2 from NHL. The median age was 8 years (range 2-15)，the median weight was 31.5 kg (range 14-55). All patients received ablative conditioning regiment according to the disease and the disease status. Conditioning regiments Cy/TBI were used for 4 patients and Bu/Cy for 21 patients，other for 7 patients. All patients received cyclosporin A and/or methotrexate for GVHD prophylaxis. The mean number of infused nuclear cells were 5.57(2.16-12.3)×107 /kg，CD34+ cells 1.78(0.85-5.59)×105. All of UCB units were tested for HLA-A，-B，and DRB1 using low and high resolution techniques .There were HLA-matched in 10，5/6 in16 and 4/6 in 6 . The results showed that 20 out of 32 patients achieved complete engraftment. Median time of neutrophil ≥0.5×109/L，and platelet≥20×10 9/L were 17(9-38) and 42(18-102) days respectively. The incidence of aGVHD Ⅱ-Ⅳ and aGVHD Ⅲ-Ⅳ were 35% and 15% respectively. After a median follow-up of 18 months (1.5-28?5)，overall survival rate at one year was 59.4%，overall survival rate at two years was 40.6%. It is suggested that UCBT is promising for children patients who is lack of matched bone marrow donors.
Key words hematopoietic stem cell transplantation，unrelated umbilical cord blood transplantation; hemtological malignancy
自1988年首例进行HLA相合的同胞脐血移植(CBT)获得成功以来，CBT迅速［1］。至今，世界上已建立50余家脐血库，保存15万例已HLA分型的脐血，并提供4千余例脐血移植［2］。山东脐血库自1999年12月至今，已冻存8 000例脐血，并为临床提供脐血移植110份。现将2001年8月至2004年6月所提供32例儿童无血缘脐血移植（URCBT）治疗血液病，其长期随访情况报告如下。
材料和方法
病例
患儿32例，男21例，女11例。中位年龄8(2-15)岁；中位体重31.5(14-55)公斤。急性淋巴细胞白血病(ALL)13例，均为高危型；急性髓系白血病(AML)9例，其中M1 1例，M2 4例，M4 3例，M5 1例；慢性髓系白血病(CML)2例；重型再生障碍性贫血(SAA)3例；急性混合性白血病(HAL)3例；非霍奇金淋巴瘤2例。
脐血采集、检测、分离和冻存
采用二联采血袋(CPDA抗凝)封闭式收集第三产程足月顺产或剖宫产的新生儿脐血。产妇无内科及产科合并症，产前血液学检查HbsAg，anti-HCV，anti-CMV，anti-HIV1/2阴性，肝功能检查未见异常，产妇夫妇双方无遗传病及家族病史。采用梯度离心法去除脐血中的红细胞和血浆，用二甲亚砜（DMSO）为冷冻保护剂，经程控降温后保存于-196℃液氮中。
供受者
HLA-A，B，DR检测采用PCR-SSO或PCR-SSP的方法。供受者ＨＬＡ全相合为10例，１个位点不相合为１6例，２个位点不相合为6例。供受者ＡＢＯ血型相合为12例，不相合20例。输入有核细胞（ＴＮＣ）5?57（2.16-12.3）×107／kg，CD34+细胞1.78(0?85-5.92)×105/kg。
预处理方案
根据疾病及其状态，移植中心采用不同预处理方案。以环磷酰胺（Cy）和全身照射（TBI）为主的Cy/TBI方案４例;以白消安（Bu）和环磷酰胺（Cy）为主的Bu/Cy方案２1例;其他方案7例。
GVHD的预防
对所有患者均采用联合免疫抑制方案，在经典的环孢菌素Ａ（CsA）基础上加甲氨喋呤（ＭＴＸ）或霉酚酸酯（ＭＭＦ）预防ＧＶＨＤ。
植入检测
所有患者造血重建均经性染色体（供受者性别不同），ＨＬＡ（供受者ＨＬＡ不全相合）或ＶＮＴＲ检测。 连续３天ＡＮＣ≥０.5×109 /L 及其在连续7天不输血小板的情况下血小板（Plt） ≥2０×109／Ｌ为造血功能恢复指标。
结 果
造血功能恢复
32例患者20例（62.5％）白细胞达到植入标准，ANC≥0.5×109/L的中位时间17（9-38）天； Plt≥20×109/L 中位时间 42(18-102)天。大于12岁的16例患者，完全植入10例，植入率为62.5%。所有患者造血重建均经性染色体（供收者性别不同），HLA（供受者HLA不全相合）或PCR-STR指纹图证明完全嵌合体。
GVHD
20例患者中16例发生aGVHD，其中Ⅰ度9例，Ⅱ度4例，Ⅲ度1例，Ⅳ度2例，Ⅱ-Ⅳ度和Ⅲ-Ⅳ度累计发生率分别为35%和15%。
其它并发症
严重细菌感染12例(37.5%)，CMV感染11例(34.4%)，严重出血3例(9.4%)，肾功能不全1例(3.1%)，肝功能不全1例(3.1%)，心功能不全1例（3.1%）。
复发及存活
随访截止2005年6月，32例患者中有14例死亡，其中 6例(18.8%)死于复发，5例(15.6%)死于严重感染，2例（6.3％）死于急性心功能衰竭，1例（3.1%）死于肝功能衰竭。存活1年以上18例，1年总生存率59.4%。存活2年以上13例，2年总生存率40.6%。
讨论
供者短缺是影响开展造血干细胞移植的主要因素。我国实行计划生育政策，在亲缘间寻找供者尤为困难，因此非血缘移植需求量很大。但我国骨髓库容量小，HLA配型要求严格，实际上为临床提供造血干细胞几率很小。我国已建立7家脐血库，保存共约3万余份脐血。脐血移植要求HLA配型不如骨髓移植严格。根据我们查询的资料，任何患者查到HLA 4个位点以上脐血概率高达96％。此外，混合脐血移植的成功也为其在大龄儿童及成年人中应用提供了良机。由此看来，脐血移植在临床上有很大的应用潜力。
1991年我们曾用非血缘混合脐血移植成功1例恶性实体瘤患儿［3］。1996年Kurzberg等［4］报道25例非亲缘脐血移植，证明非亲缘脐血移植的可行性。Wagner等［5］报道102例儿童非亲缘脐血移植，其中恶性疾病37例，88％粒细胞恢复，65％血小板恢复，2年生存率47％，移植相关死亡率30％。Ballen等［6］257例非亲缘脐血移植，1年和2年生存率分别为50％和41％。他们认为以下因素与生存时间有正相关系：①年轻患者；②输入ANC≥1.5×107/kg;③CD34细胞≥1.5×105/kg ;④白种人。本组32例，输入的ANC 5.6（2.2-12.3）×107，CD34细胞1.8(0.9-6.0)×105/kg，其中20例完全植入，ANC≥0.5×109/L的中位时间为17（9-38）天； Plt ≥20×109/L为42（18-102）天。中位随访时间15（2-37）个月，1年和2年生存率分别为59.4% 和40.6%。
非亲缘脐血移植治疗非恶性疾病方面，对遗传性疾病疗效较好，1年生存率可达75％以上；对骨髓衰竭疗效较差，1年生存率仅为20％。所以，Rocha等［7］主张母亲再孕进行同胞间脐血移植。本研究中重型再生障碍贫血3例，均没植入。
GVHD发生率低、程度轻是脐血移植的一大特点。即使供受者HLA 1-2个位点不合的情况下也是如此。据Thomson等［8］资料，非亲缘脐血移植Ⅱ－Ⅳ度GVHD发生率分别为30%-40%，Ⅲ－Ⅳ度GVHD为10%-20％，慢性GVHD为7%-10%，而骨髓移植的GVHD发生率则分别为60%-70％，20%-30％，10%-20％。本研究植入的20例患者中，16例发生aGVHD，Ⅱ-Ⅳ度7例（35％），Ⅲ-Ⅳ度3例（15％），与国外报道相仿。
本研究资料初步结果表明，严重感染与脐血移植后免疫功能重建和造血功能恢复缓慢有关。因此，有效控制感染是保证脐血移植成功的重要因素。与骨髓移植相比，脐血移植的白血病复发率不高，这是由于脐血中NK细胞数高，移植物抗白血病（GVL）较强。脐血移植长期能重建造血功能，1-2个HLA位点不合并不影响脐血植入和增加GVHD的发生率。
致谢: 感谢北京大学人民、医学院血液病医院、中国人民解放军307医院、中国人民解放军海军总医院、中国人民解放军兰州军区总医院、浙江大学医学院第一附属医院、河南省肿瘤医院、中国医科大学第二临床医院、山西医科大学第二医院、兰州医学院第一附属医院、山东大学齐鲁医院、山东省东营市人民医院给予的支持和合作。
【】
1 Gluckman E，Broxmeyer HA，Auerbach AD，et al. Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi’s anemia by means of umbilical cord blood from a HLA-identical simbling. N Engl J Med，1989; 321:1174-1178
2 Bone Marrow Donors Worldwide，Annual Report.2003.
3 沈柏均，张洪泉，候怀水等. 脐带血造血干细胞移植一例报告. 中华器官移植杂志，1991； 12：138
4 Kurtzberg J，Laughlin M，Graham ML，et al. Placental blood as a source of hematopoietic stem cells for transplantation into unrelated recipients. N Engl J Med，1996; 335:157-166
5 Wagner JE，Barker JN，DeFor TE，et al. Transplantation of unrelated donor umbilical cord blood in 102 patients with malignant and nonmalignant disease: influence of CD34 cell dose and HLA disparity on treatment-related mortality and survival . Blood，2002;100:1611-1618
6 Ballen K，Broxmeyer HE，McCullaugh J，et al. Current status of cord blood banking and transplantation in the United States and Europe. Biol Blood Marrow transplant，2001; 7:635-645
7 Rocha V，Chastang C，Pasquin R，et al. Cord blood transplantation in patients with bone marrow fail syndrome. Blood，1998; 92(10 Suppl.1): 136a
8 Thomson BG，Robertson KA，Gowan D，et al. Analysis of engraftment，graft-versus-host disease，and immune recovery following unrelated donor cord blood transplantation. Blood，2000; 96:2703-2711.
