小鼠急性粒-单核白血病WEHI-3细胞表面免疫应答分子的表达与Fas配体功能研究

          作者：刘凌波，黎纬明，何伟，邹萍

【摘要】  为了研究小鼠急性粒-单核白血病细胞株WEHI-3细胞表面免疫应答分子Fas、Fas配体（FasL）、CD80分子表达以及FasL的功能，应用流式细胞术检测WEHI-3细胞表面Fas、FasL和CD80分子表达情况，同时采用氚胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）掺入法检测FasL功能。结果表明： WEHI-3细胞表面CD80和Fas表达率分别为（5.06±0.41）％、（6.75±2.31）％（n＝5），但FasL表达率高达（63.73±5.23）％（n＝5），当WEHI-3（效应细胞，E）和Fas＋YAC-1细胞（靶细胞，T）以3∶1、10∶1和30∶1混合培养时，YAC-1细胞的凋亡率分别为（26±4.5）％，（35±3.2）％和（43±2.7）％（n＝5）。结论： WEHI-3细胞高表达FasL，低表达Fas和CD80，并能诱导Fas＋YAC-1细胞凋亡。

【关键词】  急性粒单核细胞白血病

　　Expression of Immune Response Molecules and Function of Fas Ligand on Surface of AML WEHI-3 Cells

　　Abstract    The purpose of this study was to investigate the expression of Fas、Fas ligand（FasL）and CD80 and function of FasL on the surface of acute myelomonocytic leukemia cells from WEHI-3 line. The  expression of Fas、FasL and CD80 on the surface of WEHI-3 were detected by flow cytometry，the apoptosis of YAC-1 cell induced by FasL on the surface of WEHI-3 were detected by  3H-TdR incorporation. The results showed that the expression rate of Fas、FasL and CD80 on the surface of WEHI-3 cells were (6.75±2.31)％（n＝5）、(63.73±5.23)％（n＝5）and (5.06±0.41)％（n＝5）respectively. The apoptosis rate of YAC-1 cells （target cells）co-cultured with WEHI-3 cells（Effector cells） at the rate of 1∶3、1∶10 and 1∶30 were (26±4.5)％、(35±3.2)％ and  (43±2.7)％ （n＝5）respectively. It is concluded that WEHI-3 cells have high expression of FasL and low expression of Fas and CD80 on their cell membrane，and can induce the apoptosis of  Fas+ YAC-1 cells.

　　Key words    acute myelomonocytic leukemia; FasL; Fas; CD80; WEHI-3 cell

    白血病细胞免疫逃逸可能是白血病发生、的重要环节。报道，肿瘤细胞可能主要通过以下途径逃逸机体T细胞的免疫监视：①肿瘤细胞膜高表达Ｆas配体(Fas ligand，ＦasＬ)，并通过ＦasＬ-Ｆas途径反击T细胞，②肿瘤细胞膜缺失或低表达免疫反应的正性调节因子，如共刺激分子CD80，使T细胞对肿瘤细胞抗原刺激无能应答［1-4］。因此，本研究调查小鼠急性粒-单核细胞白血病（acute myelomoncytic leukemia，AML）细胞株WEHI-3细胞表达Ｆas、ＦasＬ和CD80的状况及其功能，初步探讨急性粒-单核细胞白血病的可能的免疫逃逸机制。

　　材料和方法

　　细胞株和试剂

　　小鼠急性粒-单核细胞白血病细胞株（WEHI-3）购自医学院基础医学研究所细胞中心。小鼠T淋巴瘤细胞株YAC-1购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库。DMEM培养液、RPMI 1640培养液、胎牛血清购自Gibco BRL公司。 3H-TdR（北京原子能研究所产品），β液体闪烁测量仪为FJ-2107型（西安262厂产品），FITC标记的CD80单克隆抗体和同型对照抗体（Southern Biotech公司产品），生物素标记的抗小鼠FasL抗体和同型对照抗体，PE标记的链酶亲和素和Fc封闭抗体（CD32抗体）购自PharMingen公司，FITC标记的抗Fas单克隆抗体和同型对照抗体购自Southern Biotech公司。

　　WEHI-3表面CD80表达率检测

　　WEHI-3细胞在含10%胎牛血清、0.2 mmol/L左旋谷胺酰胺、青霉素100 U/ml、链霉素100 μg/ml的DMEM/高糖培养液中，于37℃、5% CO2、完全饱和湿度条件下传代培养。收集悬浮细胞，用台盼蓝拒染法计数，以活细胞数不低于95%的WEHI-3细胞制备密度为2.0×106/ml的单细胞悬液，取0.5 ml单细胞悬液，加入FITC标记的CD80单克隆抗体或同型对照抗体0.5 μg，4℃染色30分钟后流式细胞仪检测。同样实验重复5次。

　　WEHI-3表面FasL表达率检测

　　WEHI-3细胞经消化液消化后以每管5×105细胞悬浮，加入98 μl含2% FCS的细胞悬液和2 μl  Fc封闭抗体，4℃、5分钟后加入同样浓度的4  μl抗小鼠FasL单克隆抗体或同型对照抗体。洗涤后加入含2%   FCS的PBS 96 μl和PE标记的链酶亲和素4 μl，进行流式细胞仪检测。同样实验重复5次。

　　WEHI-3表面Fas表达率检测

　　收集悬浮的WEHI-3细胞，用台盼蓝拒染法计数，以活细胞数不低于95%的WEHI-3细胞制备密度为2.0×106/ml的单细胞悬液，取0.5 ml单细胞悬液，加入FITC标记的抗Fas单克隆抗体或同型对照抗体0.5    μg，4℃染色30分钟后流式细胞仪检测。同样实验重复5次。

　　FasL功能实验

　　采用氚胸腺嘧啶核苷（3H-thymidine，3H-TdR）掺入法检测［5］FasL功能。实验设立样品组、空白对照组和最大释放组。取0.1 ml（5×106个）YAC-1细胞，除空白对照组外每组加入1 mCi的3H-TdR，用含10%  FCS的RPMI 1640培养液于37℃、5% CO2过夜培养（15小时）。离心洗去未掺入的3H-TdR。用同位素微量加样器各取100 μl  12×104个YAC-1细胞和100 μl各种浓度的WEHI-3细胞混合于96孔培养板中；最大释放组不加WEHI-3细胞，而加抗Fas单克隆抗体100 ng/ml（可引起YAC-1细胞100%凋亡）。37℃孵育24小时，取100 μl培养上清加入含闪烁液的测量杯中，用β液体闪烁测量仪检测放射强度，结果以每分钟脉冲数（cpm）表示，并用最大释放作用进行标化。效应细胞FasL功能，即诱导凋亡的百分率=（实验组cpm-释放cpm）/（最大释放cpm-自然释放cpm）。同样实验重复5次。

　　统计学处理

　　数据以均值±标准差（x±SD）表示。

　　结 果

　　WEHI-3表面的CD80表达

　　CD80 是有效活化肿瘤特异CTL必需的共刺激信号之一，它的缺乏往往导致肿瘤特异 CTL 无能，使肿瘤细胞逃逸免疫监视；为此，我们检测了CD80在WEHI-3细胞表面表达的情况，结果发现CD80抗原的表达率很低，仅为（5.06±0.41）％（n＝5）（图1）。这提示WEHI-3细胞可能存在类似的免疫逃逸机制。

　　WEHI-3表面的Fas表达

　　Fas是FasL启动细胞凋亡的重要信号传导分子，肿瘤细胞往往通过低表达Fas而逃避T细胞的杀伤。本研究发现WEHI-3细胞表面Fas的表达率仅为（6.75±2.31）％（n＝5）（图2），这表明WEHI-3细胞表面同样低表达Fas。

　　WEHI-3表面的FasL表达率

　　FasL在很多肿瘤细胞中高表达，并杀伤Fas＋CTL，发生免疫逃逸。本实验发现WEHI-3表面FasL表达率为（63.73±5.23）％（n＝5）（图3），提示WEHI-3表面高表达 FasL 分子。

　　WEHI-3表面的FasL功能实验

　　为了探讨WEHI-3表面高表达的FasL分子能否诱导Fas＋细胞凋亡，本研究将WEHI-3细胞（效应细胞，E）与YAC-1细胞（靶细胞，T）以3∶1、10∶1和30∶1混合培养24小时后，发现YAC-1细胞的凋亡率分别为（26±4.5）％，（35±3.2）％和（43±2.7）％（n＝5）（图4），从而证实WEHI-3表面的FasL具有诱导Fas＋细胞凋亡的能力，这一结果高度提示WEHI-3表面的FasL可能参与其免疫逃逸。         

　　讨论

　　WEHI-3是小鼠急性粒-单核白血病细胞株，目前尚未见关于其免疫逃逸机制的报道。近几年来的研究证实，FasL/Fas系统反击是肿瘤免疫逃逸的主要机制之一。T细胞活化为细胞毒T淋巴细胞（CTL）后，高表达FasL，通过FasL来诱导Fas＋靶细胞的凋亡，发挥细胞毒效应；但FasL也高表达于多种肿瘤细胞，这样T细胞激活后上调Fas并对Fas介导凋亡敏感时，肿瘤细胞便可能通过FasL反向攻击杀伤T细胞。本研究证实，WEHI-3细胞的FasL表达率高达63.73％，并具有诱导Fas＋Yac-1细胞凋亡的作用，与Buzyn［3］等的研究一致。同时，肿瘤细胞还可以通过低表达Fas，对FasL/Fas系统介导的凋亡信号不敏感而发生FasL/Fas系统抵抗。本研究发现WEHI-3细胞的Fas表达率仅为6.75％，与Bremner等［5］的研究结果类似，提示WEHI-3细胞可能通过高表达FasL杀伤Fas＋CTL，通过低表达Fas而抵抗CTL的FasL攻击，导致WEHI-3逃逸CTL的免疫监视。

    机体抗白血病免疫应答的有效产生需要下列两种信号：白血病抗原肽－主要组织相容性复合物（MHC）与T细胞的抗原受体（TCR）结合，提供T细胞活化的第一信号；同时，白血病细胞和抗原呈递细胞（APC）表达共刺激因子，与T细胞上的相应配体结合，提供T细胞活化的第二信号。双信号模式是T细胞充分活化的必需条件，缺一不可［6］。与Whiteway等［4］的研究结果类似，本研究发现，WEHI-3细胞表面的CD80表达率极低，仅为5.06％。 WEHI-3细胞低表达CD80分子，使得白血病抗原在缺乏必要的共刺激信号的条件下非正常地呈递给T细胞，最终可能导致T细胞无能，从而逃避机体免疫系统的攻击。

    总之，本研究对WEHI-3细胞系的部分免疫逃逸机制进行了初步的探索，为白血病的免疫提供了实验基础。但目前发现很多机制导致肿瘤免疫逃逸，包括肿瘤抗原表达异常、MHC依赖性抗原提呈途径异常、以及T细胞信号转导缺陷等［7-9］，在WEHI-3细胞是否也同时存在，仍需进一步研究证实。

【】
  　　1Walker PR，Saas P，Dietrich PY. Role of Fas ligand (CD95L) in immune escape: the tumor cell strikes back. J Immunol，1997; 158:4521-4524

　　2Lickliter JD，Kratzke RA，Nguyen PL，et al. Fas ligand is highly expressed in acute leukemia and during the transformation of chronic myeloid leukemia to blast crisis. Exp Hematol，1999; 27:1519-1527

　　3Buzyn A，Petit F，Ostankovitch M，et al. Membrane-bound Fas (Apo-1/CD95) ligand on leukemic cells: a mechanism of tumor immune escape in leukemia patients. Blood，1999; 94:3135-3140

　　4Whiteway A，Corbett T，Anderson R，et al. Expression of co-stimulatory molecules on acute myeloid leukaemia blasts may effect duration of first remission. Br J Haematol，2003; 120:442-451

　　5Bremner TA，Chatterjee D，Han Z，et al. THP-1 monocytic leukemia cells express Fas ligand constitutively and kill Fas-positive Jurkat cells. Leuk Res，1999; 23:865-870

　　6Brouwer RE，Zwinderman KH，Kluin-Nelemans HC，et al. Expression and induction of costimulatory and adhesion molecules on acute myeloid leukemic cells: implications for adoptive immunotherapy. Exp Hematol，2000; 28:161-168

　　7Furukawa Y，Kubota R，Tara M，et al. Existence of escape mutant in HTLV-I tax during the development of adult T-cell leukemia. Blood，2001; 97:987-993

　　8Mohty M，Jarrossay D，Lafage-Pochitaloff M，et al. Circulating blood dendritic cells from myeloid leukemia patients display quantitative and cytogenetic abnormalities as well as functional impairment. Blood，2001; 98:3750-3756

　　9Chen X，Woiciechowsky A，Raffegerst S，et al. Impaired expression of the CD3-zeta chain in peripheral blood T cells of patients with chronic myeloid leukaemia results in an increased susceptibility to apoptosis. Br J Haematol，2000; 111:817-825