白血病细胞可变铁池的检测及其意义
作者：贾国存，高举，廖清奎，李丰益，袁粒星，何斌
【摘要】 为了研究细胞可变铁池(labile iron pool，LIP)的检测方法，用不同浓度的去铁胺（DFO）与K562及HL- 60细胞共同培养0、6、12、24、48小时，用钙荧光素（caicein）负荷K562及HL- 60细胞，荧光分辨仪检测细胞荧光量；用快速铁螯合剂螯合铁，使恢复荧光，然后2次荧光差值。结果表明： 浓度为50和100 μmol/L 的DFO作用于K562及HL- 60细胞12小时后，荧光值明显高于对照组（P<0.05），且LIP的荧光差值（ΔLIP）随DFO作用时间的延长及浓度增加而降低，即呈一定的时间及剂量依赖性。 结论： DFO通过螯合细胞内铁 降低了白血病细胞LIP； calcein AM荧光可作为检测细胞LIP变化的比较可靠的方法。
【关键词】 铁
Detection of the Labile Iron Pool in Leukemia Cells and Its
Significance
Abstract To explore a rapid and easy method to detect labile iron of pool (LIP) in cells，HL- 60 and K562 cells were cultured at a concentration 1×106/ml in RPMI 1640 containing 10% heat- inactivated fetal bovine serum. The iron deprivation was induced by adding desferrioxamine (DFO) 10-100 μmol/L for 0-48 hours. The intracellular LIP was measured by probe calcein-AM. Calcein fluorescence was monitored in 1420 multilabel counter. The results indicated that when HL- 60 and K562 cells were incubated with different concentrations of DFO，the calcein fluorescence intensity was higher than that of control group at 12，24 and 48 hours (P<0.05). Fluorescence value of representing LIP in DFO groups was lower than that in the control group. In conclusion，DFO can decrease LIP in leukemia cells. The approach used in this study may provide a simple and reliable method for detection of intracellular iron homeostasis.
Key words iron; desferrioxamine; K562; HL- 60
铁是细胞维持正常功能活动所必需的元素，但过多的铁又可损伤细胞。细胞铁水平受铁代谢相关蛋白（转铁蛋白-转铁蛋白受体，铁蛋白）的共同调节而维持平衡，其调节机制与胞浆铁调节蛋白与铁反应元件的结合有关。虽然细胞内铁有不同的结合形式和不同的配体，但目前认为能够反映细胞铁状态和能够被铁调节蛋白感受的铁是胞浆中结合力较弱、分子量较小的那部分铁，即可变铁池（labile iron pool，LIP）［1］。然而，过去一直缺少比较可靠的直接检测细胞LIP的方法。新近我们应用一种荧光探针标记的方法检测活细胞LIP，观察在铁螯合的状态下细胞LIP的变化，现报告如下。
材料和方法
材料
细胞株
人白血病细胞株K562为本实验室保存株；HL- 60细胞引自四川大学基础与法医学院细胞分子生物学实验室。
主要试剂及仪器
钙荧光素乙酰氧基甲酯(calcein acetoxymethyl ester，calcein AM)（Sigma公司产品），BIP（2，2-Bipyridine，Sigma产品）；去铁胺（desferrioxamine，DFO瑞士产品)，RPMI 1640培养液（Gibco产品），特级新生牛血清 （Hyclone公司产品）；HEPES（Boehringer Mannheim公司产品），DMSO（上海试剂公司产品），HBS：150 mmol/L NaCl(上海生物工程公司产品)、20 mmol/L HEPES (上海生物工程公司产品)，台盼蓝（Sigma公司产品）。多功能分辨荧光仪（1420 multilabel counter.WALLAC公司产品）；倒置荧光显微镜(Olympus公司产品)。
方法
细胞处理
将K562、HL- 60细胞置于含10%灭活小牛血清中，在37℃、5% CO2培养箱中悬浮培养，每2-3天传代1次，取对数生长期细胞进行实验，0.4%台盼蓝鉴定细胞活性在98%以上。
实验分组
选择DFO浓度为：10、50和100 μmol/L（终浓度）为实验浓度，加于K562、HL- 60细胞培养液中，以生理盐水代替DFO作为空白对照，观察不同浓度DFO对K562、HL- 60细胞LIP的影响。
Calcein AM标记及细胞LIP检测
按［1-3］提供的方法，略加改进。具体方法为： 收集细胞，用PBS洗2次；重悬细胞于PBS中，调细胞浓度为１×106，加入calcein AM，终浓度为0.125 μmol/L，37℃×1 0分钟孵育;室温条件下加入PBS，2 000×g离心5分钟×2次，洗去过多的calcein AM，重悬于PBS中;加入台盼蓝（0.25 μg/ml），猝灭细胞外荧光;荧光分光光度计检测荧光强度: 激发波长为495 nm；发射波长为530 nm;加入铁螯合剂BIP，终浓度为100 μmol/L，作用30分钟，检测荧光强度;倒置荧光显微镜观察拍照。
结果
用0.25 μmol/L的calcein AM负荷细胞，添加台盼蓝（0.25 μg/ml）以猝灭细胞外过多的calcein，上机检测细胞荧光：激发波长495 mm；发射波长530 mm。加入BIP并检测细胞荧光，2次荧光的差值即为LIP的变化量（△LIP）。本实验结果显示，DFO作用于HL- 60细胞24小时LIP的变化：对照组为42 754±2 399，10 μmol/KL组为 36 278±1 556，50 μmol/L组为 17 728±2 551，100 μmol/L组为 6 246±4 836，与对照组相比P＜0.05；DFO作用于K562细胞48小时LIP的变化：对照组为58 533±4 359，10 μmol/L组为 56 700±5 629，50 μmol/L组为 3 3570±5 250，100 μmol/L组为 10 800±4 509，与对照组相比P＜0.05。即DFO降低了K562及HL- 60细胞LIP（图1-3 ）。
讨 论
铁通过内吞膜转入胞浆后进入细胞内铁池，称之为可变铁池［3，5］。目前认为，细胞内可变铁池是指细胞内可被螯合的、参与氧化还原反应的那部分铁，具有以下功能：①转输细胞铁；②表达铁代谢相关基因（如TfR、FT）；③催化Fenton反应；④调节含铁蛋白的活性。Epsztejn等［3］首先报道了采用钙荧光素（calcein）测定细胞LIP的变化。calcein- AM是一种荧光染料，可以主动穿过细胞膜，一旦进入细胞，乙酰甲基化酯被分解，calcein游离出来。脱酯的calcein滞留在细胞浆中，发出荧光。在细胞内，calcein可以与Fe2+，3+结合，在生理pH条件下几乎不与其它金属离子结合，即使有很小量的结合，对添加铁螯合剂所增加的荧光几无影响。当铁与calcein结合后，荧光猝灭。铁和calcein的结合是可逆性的。在不同实验条件下，细胞内的LIP水平升高时，由于铁与calcein结合，荧光减弱。而LIP水平降低时，荧光就增加。因此，测定的荧光变化量可作为定量细胞LIP的标志。本实验结果显示，在DFO作用下，测定的K562和HL- 60细胞荧光值增加，表明DFO降低了细胞的LIP，且呈现时间及剂量依赖性。K562细胞荧光值和HL- 60细胞相比，后者变化比前者明显，可能与细胞内铁贮存量有关。
铁参与机体的许多生理病理过程［6，7］。已有的研究及相关研究显示，一定量的铁可促进肿瘤细胞生长，而铁螯合可诱导肿瘤细胞凋亡，并推测与铁螯合剂导致肿瘤细胞LIP的改变有关［8］，但由于缺少检测LIP的方法，则无法提供细胞铁LIP变化的直接证据。我们这里所介绍的方法的依据，是calcein与铁快速可逆结合的特性，而这种结合可很快达到平衡。添加铁螯合剂使细胞荧光增强，前后荧光的变化量即表示了细胞的LIP水平。该方法的建立，为探讨细胞铁在不同的病理生理变化及铁在细胞分化、凋亡中的作用，提供了一个比较可靠的检测手段。
【】
1Richardson DR，Ponka P. The molecular mechanisms of the meta- bolism and transport of iron in normal and neoplastic cells. Biochim Biophys Acta，1997; 1331:1-40
2Cabantchik ZI，Glickstein H，Milgram P，et al. A fluorescence assay for assessing chelation of intracellular iron in a membrane model system and in mammalian cells. Anal Biochem，1996; 233: 221-227
3Epsztejn S，Kakhlon O，Glickstein H，et al. Fluorescence analysis of the labile iron pool of mammalian cells. Anal Biochem，1997; 248: 31-40
4Roy CN，Blemings KP，Deck KM，et al. Increased IRP1 and IRP2 RNA binding activity accompanies a reduction of the labile iron pool in HFE- expressing cells. J Cell Physiol，2002;190: 218-226
5Kakhlon O，Cabantchik ZI. The labile iron pool: characterization，measurement，and participation in cellular processes(1). Free Radic Biol Med，2002; 33:1037-1046
6王强，廖清奎. 一氧化氮对慢性病贫血大鼠铁代谢影响.实验血液学杂志，2003;11: 385-386.
7Buss JL，Torti FM，Torti SV. The role of iron chelation in cancer therapy. Curr Med Chem，2003;10: 1021-1034
8贾国存，刘玉峰. 富铁对HL- 60细胞增生及化疗药物诱导HL- 60细胞凋亡的影响.中华血液学杂志，2001; 22: 381-382
9Richardson DR. Potential of iron chelators as effective antiproliferative agents. Can J Physiol Pharmacol，1997; 75: 1164-1180
