急性髓细胞性白血病细胞培养上清对CD4+ 和CD8+ T细胞增殖和凋亡的影响
作者：王兴兵，刘隽，贺艳丽，谷俊侠，郑金娥，姚军霞，杨晶，李小青，黄士昂
【摘要】 为了研究不同的急性髓细胞性白血病（AML）细胞株培养上清对CD4+和CD8+ T细胞增殖以及凋亡的影响，探讨AML的免疫抑制的形成机制，将3种AML细胞株（HL-60、NB4和U937）培养上清和普通培养液按不同比例混合，用于培养CFSE染色的淋巴细胞。抗CD3抗体和抗CD28抗体刺激3天后，标记7AAD和相应荧光抗体。利用流式细胞术检测不同T细胞亚群CFSE荧光强度和7AAD表达率的变化，分析其增殖和凋亡变化情况。结果表明： 3种AML细胞株中有2种（HL-60和NB4）培养上清可显著抑制CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的增殖，并随浓度增加而增强。同样，HL-60和NB4细胞株培养上清亦可抑制刺激后的CD4+ T细胞的凋亡，但对刺激后的CD8+ T细胞的凋亡并无明显影响。相反，HL-60和NB4细胞株培养上清可显著增加增殖的CD8+ T细胞的凋亡。结论： AML细胞株培养上清液对CD4+ T细胞和CD8+ T细胞增殖的抑制以及对增殖的CD8+ T细胞凋亡的诱导作用，可能是AML患者免疫功能缺陷的机制之一。
【关键词】 急性髓细胞性白血病
Effects of Acute Myeloid Leukemia Cell Supernatant on the Proli-feration and Apoptosis of CD4+ and CD8+ T Cell Subsets
Abstract To study the effects of supernatant derived from acute myeloid leukemia (AML) cell lines on proliferation and apoptosis of CD4+ and CD8+ T cell subsets and to investigate the mechanism by which AML escapes from immune recognition，lymphocytes were labeled with CFSE and were stimulated with anti-CD3 and anti-CD28 in presence or absence of supernatants from three AML cell lines (HL-60，NB4，U937). After culture，cell suspensions were labeled with 7AAD and CD4 PE (or CD8 PE). Cells were then detected by flow cytometry and their proliferation and apoptosis were analyzed. The results showed that supernatants from two of three cell lines (HL-60 and NB4) inhibited the proliferation of CD4+ and CD8+ T cells，and the degree of inhibition showed a dose-dependent way. Similarly，the apoptosis of stimulated CD4+ T cells was inhibited，but stimulated CD8+ T cells remained unaffected by supernatant from HL-60 and NB4. In contrary，the apoptosis of proliferative CD8+ T cells were increased significantly by HL-60 and NB4 supernatant. It is concluded that soluble factors derived from AML cell lines inhibit the proliferation of CD4+ and CD8+ T cells and induce the apoptosis of proliferative CD8+ T cells，that may be one of the mechanisms by which the immunity was suppressed.
Key words acute myeloid leukemia; CD4+T cell; CD8+ T cell; cell proliferation; apoptosis
急性髓细胞性白血病（AML）患者免疫功能的抑制是其发病率和死亡率增加的一个重要原因。研究显示，包括AML细胞在内的多种肿瘤细胞可通过分泌抑制性细胞因子影响T淋巴细胞的增殖和凋亡，进而发挥其免疫抑制功能［1-3］。但是，这些抑制性细胞因子对不同T细胞亚群功能的影响目前尚不清楚。CFSE是一种能自发不可逆地结合与细胞蛋白质上的活体荧光染料。当细胞分裂时，CFSE可平均分配到2个子代细胞中，其荧光强度将是亲代细胞的一半，并且能够利用流式细胞仪进行检测（F1通道）和分析。如同时标记不同的荧光抗体，则可实现对1个增殖细胞群内不同细胞亚群的增殖研究［4］。本研究采用上述方法观察白血病细胞培养上清对CD4+ 和CD8+ T细胞的增殖影响，同时利用7AAD检测不同T细胞亚群凋亡的变化情况，探讨AML免疫抑制的形成机制，以期为白血病的生物提供可能的新思路。
材料和方法
细胞株及主要试剂
AML细胞株HL-60和NB4分别由附属协和血液病研究所吴青博士和李新刚博士惠赠，U937细胞株为本研究室所有。RPMI 1640培养液、胎牛血清购自Gibco公司，抗CD3抗体和抗CD28抗体购自R&D公司，CFSE染料购自Molecular Probes 公司。藻红蛋白（PE）标记的CD4抗体和CD8抗体以及7AAD购自PharMingen公司。FACS Caliber流式细胞仪为美国Becton Dickison公司产品。
AML细胞株培养及上清收集
于37℃、 5% CO2孵箱中，以含10% FBS的RPMI 1640培养液培养AML细胞（HL-60、NB4和U937，浓度均为2×105），24小时后收集培养上清，滤去杂质，分别标记为HL-60-S、 NB4-S和U937-S，-20℃保存备用。
淋巴细胞悬液的制备及CFSE染色
抽取健康志愿者的外周静脉血，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞（PBMNC），用RPMI 1640重悬，于37℃、5% CO2孵箱中培养2小时，取出非贴壁细胞，用PBS洗涤，调整浓度为1×107/ml。CFSE用DMSO溶解成10 mmol/L的储存液，-20℃保存。临用前取适量用PBS稀释成5 μmol/L。加等量的CFSE稀释液入淋巴细胞悬液中，充分混匀，37℃下轻荡10分钟后，加等量的冰冷RPMI 1640（含10% FBS）中止反应，1分钟后用PBS洗涤2次，悬浮于含10% FBS的RPMI 1640 培养液中。
刺激淋巴细胞增殖
将AML细胞株培养上清和10% FBS的RPMI 1640培养液按不同体积比混合，放于96孔培养板内培养CFSE标记的淋巴细胞（浓度为1×106/ml），加入可溶性anti-CD3抗体（2 μmol/L）和anti-CD28抗体（1 μmol/L），5% CO2、37℃孵箱中培养72小时后，收集细胞。每组重复5次。
淋巴细胞增殖和凋亡的检测与分析
收集的培养细胞经PBS离心洗涤2次后，重悬于100 μl PBS中，分别加入抗-CD4-PE/抗CD8-PE和7AAD 5 μl，混匀后4℃避光孵育20分钟，经PBS洗涤后上流式细胞仪检测，CELL Quest软件获取并分析。在FSC/SSC二维散点图上设淋巴细胞门G1，在CD4/SSC或CD8/SSC散点图上设CD4+/CD8+淋巴细胞门G2，分析G1和G2门内的细胞CFSE荧光强度的变化，出增殖细胞的前体频率（precursor frequency，PF），即亲代中发生增殖的细胞所占的比例（图1）。同样，如图2所示，结合7AAD的表达情况，可计算出总CD4+ 和CD8+ T细胞中凋亡细胞的比例（即R1+R3/R1+R2+R3+R4）以及增殖的CD4+ 和CD8+ T细胞中凋亡细胞的比例（即R1/R1+R2）。
结果
AML细胞株培养的上清对CD4+ 和CD8+ T细胞增殖的影响
利用CFSE的研究显示：anti-CD3抗体和anti-CD28抗体刺激72小时之后，CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的增殖细胞的前体频率分别为（17.3±1.8）%和（22.9±1.9）%，HL-60和NB4细胞株培养的上清可明显抑制二者的增殖，其增殖细胞的前体频率随浓度的增加而降低。10%、30%和50%浓度培养的上清中，HL-60组：CD4+ T细胞的增殖细胞前体频率分别为(11.2±1.1)%、(7.8±0.9)%和(3.5±0.7)%； CD8+ T细胞的增殖细胞前体频率分别为（18.4±1.6）%、（13.9±1.5）%和（7.8±0.8）%；NB4组：CD4+ T细胞的增殖细胞前体频率分别为(12.8±1.3)%、(9.4±1.0)%和(5.6±0.8)%； CD8+ T细胞的增殖细胞前体频率分别为（19.2±1.9）%、（15.7±1.7）%和（10.4±1.1）%。各浓度U937细胞株培养上清对CD4+ 和CD8+ T细胞的增殖均无明显影响（图1B）。
AML细胞株培养的上清对CD4+ 和CD8+ T细胞凋亡的影响
结果如图3所示，anti-CD3抗体和anti-CD28抗体刺激72小时后，CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的凋亡率分别为（12.3±1.2）%和（8.1±0.7）%，HL-60和NB4细胞株的培养上清液可明显抑制CD4+ T细胞的凋亡，并随浓度的增加而降低。10%、30%和50%浓度中，HL-60组的凋亡率分别为（8.5±1.1）%、（7.6±0.8）%和（5.8±0.5）%，NB4组的凋亡率分别为（8.9±1.4）%、（7.2±1.1）%和（6.4±0.9）%，两组中对CD8+ T细胞的凋亡均无明显影响。
进一步分析增殖的CD4+ 和CD8+ T细胞的凋亡情况显示，对照组中两种细胞的凋亡率分别为（16.4±1.8）%和（13.4±2.1）%，HL-60和NB4细胞株上清液可显著增强增殖的CD8+ T细胞的凋亡，10%、30%和50%浓度中，HL-60组的凋亡率分别为（19.7±2.3）%、（32.7±4.3）%和（39.9±6.7）%，NB4组的凋亡率分别为（22.4±3.6）%、（29.6±5.2）%和（34.3±5.7）%，但两组中对增殖的CD4+ T细胞的凋亡均无明显影响。
此外，各浓度U937细胞株培养上清对CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、增殖的CD4+ 和增殖的CD8+ T细胞的凋亡均无明显影响。
讨论
CD4+ 和CD8+ T细胞作为外周血中两个主要的T细胞亚群，其活化、增殖和凋亡的改变可能对免疫应答强弱的起到重要的调控作用，因此，研究肿瘤细胞对二群细胞增殖和凋亡的影响对于了解包括AML在内的肿瘤患者免疫抑制的机制以及免疫方案的制定具有重要的意义。
CFSE标记已被证实与标准的增殖技术3H-TdR和BrdU标记有明显的相关性，但它可同时提供更多的信息［5］，例如：① 传统的方法通常只能在群体细胞水平上检测增殖，当整个细胞群分裂1次时所掺入的3H-TdR量与1/3的细胞分裂2次是相同的，而CFSE技术可对某群细胞的增殖进行可视话与数量化研究；② 传统的方法只能对活细胞进行检测，忽视了某些细胞已经分裂又发生死亡的可能性，而使用CFSE标记，死亡的细胞将在几天内保持荧光强度基本不变，同时可使用某些染料（如本研究中使用的7AAD）将其分开，为增殖研究提供更为全面的资料；③ 如同时标记不同的荧光抗体，则可实现对1个增殖细胞群内不同细胞亚群的增殖研究，这是传统检测增殖的方法（包括3H-TdR掺入法和MTT法）所无法比拟的，或者需要大量的工作才能取得类似的结果。本研究首次采用CFSE、联合7AAD和相应的荧光抗体观察了AML细胞HL-60培养上清对CD4+和CD8+ T细胞增殖和凋亡的影响。
本研究的结果表明，AML细胞株HL-60和NB4培养上清液可显著地抑制CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的增殖，而U937细胞株培养上清对CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的增殖均无明显影响。此结果说明不同的AML细胞株所分泌的免疫抑制物质存在差异，目前对于这种或这些免疫抑制物质的成分尚不清楚。Buggins等［1］研究发现，AML细胞培养上清可抑制NF-κB、c-Myc和pRb通路的活化，进而阻止T细胞的激活和Th1细胞因子的产生以及激活的T细胞进入细胞增殖周期，但所含的抑制因子不同于以往所发现的因子，如神经节苷脂（ganglioside）、NO、TGF-b、IL-10、VEGF和PG等。
关于AML细胞对T细胞凋亡的影响，已有的研究表明：AML细胞培养的上清可通过抑制caspase-3、-8和-9的活化，减少静息的以及刺激的总T细胞的凋亡［2］。我们的实验进一步发现，AML细胞株培养的上清对不同T细胞亚群凋亡的影响存在差异，即，HL-60和NB4细胞培养的上清液可显著抑制anti-CD3 和anti-CD28抗体刺激的CD4+ T细胞的凋亡，但对CD8+ T细胞的凋亡并无明显影响。引起CD4+ T细胞凋亡明显降低的原因可能包括：①增殖的减弱伴活化诱导的细胞凋亡（AICD）的降低；②AML细胞可能分泌某些抗T细胞凋亡的物质［2］。尽管CD8+ T细胞的增殖明显减弱，但其凋亡率并无明显降低，说明HL-60和NB4细胞可能分泌某些因子诱发CD8+ T细胞的凋亡，从而弥补因增殖减弱所致的AICD的降低。进一步对已发生分裂增殖的T细胞的凋亡进行研究时发现，HL-60和NB4细胞培养的上清可显著增强CD8+ T细胞的凋亡。众所周知，CD8+ 的细胞毒性T细胞是体内介导肿瘤免疫的主要成分。Hoffmann等［6］ 和Tsukishiro等［7］报道：头颈部肿瘤患者外周血和肿瘤组织局部CD8+ T细胞的凋亡明显增加，并且主要由CD8+ 效应性细胞T凋亡的增加所致。本研究中所发现的HL-60和NB4细胞培养上清对CD8+ T细胞增殖的抑制和凋亡的诱导作用是否会选择性导致CD8+效应T细胞的减少，还有待于进一步证实。
总之，AML细胞可能分泌某种或某些免疫抑制物质，抑制CD4+ 和CD8+ T细胞的增殖，并促进CD8+ T细胞的凋亡，这可能是AML患者免疫功能抑制的一个机制。进一步确定这些抑制性物质，恢复CD4+ 和CD8+ T细胞的增殖以及保护CD8+ T细胞免于凋亡可能是AML免疫的新靶点。
【】
1Milojkovic D，Devereux S，Westwood NB，et al. Antiapoptotic microenvironment of acute myeloid leukemia. J Immunol，2004;173:6745-6752
2Buggins AG，Milojkovic D，Arno MJ，et al. Microenvironment produced by acute myeloid leukemia cells prevents T cell activation and proliferation by inhibition of NF-kappaB，c-Myc，and pRb pathways. J Immunol，2001;167:6021-6030
3Reichert TE，Strauss L，Wagner EM，et al. Signaling abnormalities，apoptosis，and reduced proliferation of circulating and tumor-infiltrating lymphocytes in patients with oral carcinoma. Clin Cancer Res，2002; 8:3137-3145
4Hasbold J，Gett AV，Rush JS，et al. Quantitative analysis of lymphocyte differentiation and proliferation in vitro using carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Immunol Cell Biol，1999; 77:516-522
5Marin L，Minguela A，Torio A，et al. Flow cytometric quantification of apoptosis and proliferation in mixed lymphocyte culture. Cytometry A，2003; 51:107-118
6Hoffmann TK，Dworacki G，Tsukihiro T，et al. Spontaneous apoptosis of circulating T lymphocytes in patients with head and neck cancer and its clinical importance. Clin Cancer Res，2002; 8:2553-2562
7Tsukishiro T，Donnenberg AD，Whiteside TL. Rapid turnover of the CD8(+)CD28(-) T-cell subset of effector cells in the circulation of patients with head and neck cancer. Cancer Immunol Immunother. 2003; 52:599-607
