性连锁凋亡抑制蛋白及其拮抗蛋白在急性白血病中的表达及意义
作者：陈广华，林凤茹，任金海，陈静，张静楠，王艳，王静
【摘要】 为了研究急性白血病(AL)性连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis proteins，XIAP)和XIAP相关因子1(XIAP-associated factor 1，XAF1)的表达及其临床意义，应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测116例AL患者和17名正常人骨髓单个核细胞中XIAP、XAF1、Smac和HtrA2 mRNA的表达，并分析其与临床效果的关系。结果表明： 初治AL患者XIAP mRNA表达水平(0.990±0.337)明显高于正常对照(0.395±0.148) (P<0?01)； 初治AL患者XAF1 mRNA阳性率及表达水平(56.3%，0.246±0.267)明显低于正常对照(100%，0.964±0.387) (P<0.01)； 69例初治AL患者中高表达XIAP患者完全缓解率明显低于低表达患者(P<0.01)； XAF1阳性表达患者完全缓解率明显高于阴性表达患者(P<0.01)。结论： XIAP在AL中异常高表达，XAF1在AL中异常低表达，XIAP高表达及XAF1低表达或阴性可能是AL患者不良预后的指标。
【关键词】 XIAP; XIAP相关因子1; Smac; HtrA2; 急性白血病
Expression and Significance of X-linked Inhibitor of Apoptosis Protein and Its Antagonized Proteins in Acute Leukemia
Abstract To investigate the expression and significance of X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP) and XIAP-associated factor 1 (XAF1) in acute leukemia，the expression of XIAP，XAF1，Smac，and HtrA2 mRNA in the bone marrow aspirates from 87 newly diagnosed AL patients，23 patients in remission，6 patients in relapse，and 17 normal controls were detected by means of reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)，and their relationship with clinical therapeutic efficiency was analyzed. The results showed that the expression level of XIAP mRNA in newly diagnosed AL patients (0.990±0.337) was significantly higher than that in normal controls (0.395±0.148) (P<0?01); the positive rate and expression level of XAF1 mRNA in newly diagnosed AL patients (56.32%，0.246±0.267) were significantly lower than that in normal controls (100%，0.964±0.387) (P<0.01). In 69 out of 87 newly diagnosed AL patients，efficacy remained evaluable. AL patients with high level of XIAP achieved a lower complete remission (CR) rate than patients with low level of XIAP (54.55% and 86.11%，respectively) (P<0.01). XAF1 positive patients achieved a higher CR rate than XAF1 negative patients (86.84% and 51.61%，respectively) (P<0.01). It is concluded that the overexpression of XIAP and negativity of XAF1 may be two adverse prognostic factors in AL patients.
Key words XIAP; XAF1; Smac; HtrA2; acute leukemia
凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis proteins，IAP）是细胞内一类独特的阻止细胞死亡的蛋白家族成员，主要通过结合并抑制caspase-3、caspase-7和caspase-9而产生抑制凋亡的作用，除此之外还参与调控细胞分裂和胞内信号转导途径，目前共发现XIAP、Survivin 、c-IAP1和c-IAP2等8个成员，多个癌细胞株存在IAP表达异常［1］。性连锁凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）是IAP中抑制caspase活性最强的成员，XIAP抑制caspase活性至少受XAF1、Smac (second mitochondria-derived activator of caspase)和HtrA2 (high temperature requirement protein A2) 3个内源性抑制蛋白负调控［2］。近来有研究显示，癌细胞株中XIAP和XAF1表达异常［3］，我们利用RT-PCR方法检测了急性白血病中XIAP 、XAF1、Smac和HtrA2 mRNA的表达，并分析了XIAP和XAF1表达与急性白血病临床治疗效果的关系。
材料和方法
研究对象
急性白血病患者116例，男72例，女44例，年龄14-73岁(中位年龄40岁)，为2003年1月-2004年12月本院血液科住院患者，按照FAB分型标准诊断分型，初治患者87例（其中AML患者74例，ALL患者13例），完全缓解期患者23例，复发患者6例。17名正常人骨髓作为正常对照，男10名，女7名，年龄18-52岁（中位年龄30岁）。
标本采集及单个核细胞分离
所有标本均为无菌条件下抽取的2-3 ml肝素抗凝骨髓液，淋巴细胞分离液（密度1.077 g/ml，上海试剂二厂）密度梯度离心分离单个核细胞层，PBS洗涤2次，-80℃冻存备用。NB4、K562、HL-60及KG-1a白血病细胞株由本科室保存。
治疗方案及疗效标准
对于初治AML患者采用标准DA（柔红霉素和阿糖胞苷）化疗方案进行诱导缓解治疗。复发AML患者采用AME（阿糖胞苷、米托蒽醌和足叶乙甙）、IA（去甲氧柔红霉素和阿糖胞苷）等化疗方案治疗。APL患者采用全反式维甲酸（ATRA）或ATRA与三氧化二砷（As2O3）合用或以ATRA为主，联合应用小剂量DA、HA（高三尖杉酯碱和阿糖胞苷）方案进行诱导分化治疗。对于ALL患者选用VCDP（长春新碱、环磷酰胺、柔红霉素和泼尼松）化疗方案治疗。疗效判断参照张之南等主编的第二版《血液病诊断及疗效标准》。
细胞总RNA的提取
取1×106个单个核细胞，加入1 ml TRIZOL试剂（Gibco公司产品）提取细胞总RNA。所提取的总RNA经紫外分光光度计(Bio-Rad公司产品)测定260 nm和280 nm吸光度（A）值及总RNA浓度，A260/A280值在1.80以上者用于RT-PCR，RNA浓度稀释至1 μg/μl。
RT-PCR检测
cDNA合成
30 μl逆转录体系含有： 5×逆转录反应缓冲液6 μl，M-MLV逆转录酶200 U（Promega公司产品），RNasin 25 U（Promega公司产品），50 μg/ml随机六聚体引物1 μl，细胞总RNA 3 μl，10 mmol/L dNTP 1.5 μl，用DEPC水补足至30 μl。37℃反应60分钟，95℃ 5分钟灭活逆转录酶。
PCR扩增
25 μl PCR扩增体系包括： 10×PCR反应缓冲液2.5 μl，Taq DNA聚合酶1 U（Promega公司产品），逆转录产物1.5 μl，10 pmol/μl上下游引物各2 μl，10 mmol/L dNTP 0.5 μl，用三蒸馏水补足至25 μl。反应在DNA扩增仪（美国Perkin Elmer公司产品）上进行。在扩增之前均94℃变性5分钟。XIAP引物及反应条件参照［4］，扩增产物大小为502 bp。根据XAF1、Smac和HtrA2相应GenBank的登录号NM-017523、NM-019887和NM-013247用Premier Primer 5.0软件设计引物序列（表1）。以β-actin作为内对照。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。XAF1的扩增条件为94℃变性40秒，65℃退火60秒，72℃延伸60秒，37个循环；Smac的扩增条件为94℃变性40秒，54℃退火60秒，72℃延伸60秒，32个循环；HtrA2的扩增条件为94℃变性40秒，56℃退火60秒，72℃延伸60秒，37个循环；β-actin的扩增条件为95℃变性60秒，55℃退火60秒，72℃延伸60秒，30个循环。最后均72℃延伸10分钟。
PCR扩增产物电泳分析 取5 μl PCR扩增产物在20 g/L琼脂糖凝胶（含溴化乙锭）上电泳，紫外照相并进行扫描分析，XIAP、XAF1、Smac和 HtrA2相对表达水平以与管家基因β-actin的比值。Table 1. PCR primer sets（略）
统计学处理
两样本比较采用t检验，数据比较采用χ2检验，P<0.05为差异有显著性。
结果
XIAP mRNA的表达
所有标本均表达XIAP mRNA，但表达水平不同。初治AL患者的XIAP mRNA平均表达水平为0.990±0.337，正常对照为0.395±0.148，前者明显高于后者（P<0.01）；ALL患者的平均表达水平（1.040±0.342）高于AML患者（0.971±0.343），但两组间差异无统计学意义（P>0.05）。复发患者的表达水平（1.276±0.309）不但明显高于正常对照（P<0?01），而且高于初治AL组（P<0.05）。缓解患者的平均表达水平为 0.655±0.219，明显低于初治AL患者，差异有统计学意义（P<0.01），但仍高于正常对照（P<0.05）。4个细胞株平均表达水平为1?260（表2和图1）。
XAF1 mRNA的表达
正常对照均表达XAF1 mRNA，平均的表达水平为0?964±0.387。初治AL患者的XAF1 mRNA 阳性率为56.32%，明显低于正常对照（100%），差异有统计学意义（P<0.01）；AML患者的表达阳性率为（56.76%），高于ALL患者（53.85%），但差异无统计学意义（P>0.05）。复发患者的表达阳性率为33?33%，明显低于正常对照（P<0.01），但与初治AL患者相比差异无统计学意义（P>0.05）。缓解患者的表达阳性率（78.26%）高于初治AL组（P<0?01），但低于正常对照（P<0.01）。NB4、K562、HL-60和KG-1a 4个细胞株仅HL-60低表达XAF1 mRNA（表2及图1和2）。
Smac mRNA的表达
所有标本仅部分表达Smac mRNA。正常对照的阳性表达率为23.53％，初治AL患者的阳性表达率为65.52％；明显高于正常对照（P<0.01）。复发患者的阳性表达率为83.33%，明显高于正常对照（P<0.01），但与初治AL患者相比差异无统计学意义（P>0.05）。缓解患者的阳性表达率为43.48％，低于初治AL患者（P<0.05）（表2和图3）。
HtrA2 mRNA的表达
所有标本均表达HtrA2 mRNA。正常对照表达水平为0.788±0.230，初治AL患者的表达水平为1.043±0.380，明显高于正常对照，差异有统计学意义（P<0.01）。复发患者的表达水平为1.226±0.454，明显高于正常对照（P<0.01），但与初治AL患者的差异无统计学意义(P>0.05)。缓解患者表达水平（0.829±0.296）低于初治AL患者（P<0.05）（表2图4）。Table 2. Expression of XIAP，XAF1，Smac，and HtrA2 mRNA in AL patients and normal controls（略）
疗效评估
87例初治AL患者中69例可进行疗效评估。33例XIAP mRNA高表达（表达水平≥0.990，XIAPhigh）患者中有18例获完全缓解，完全缓解率54.55％，36例XIAP mRNA低表达（表达水平＜0.990，XIAPlow ）患者中有31例获完全缓解，完全缓解率86.11％，低表达患者缓解率明显高于高表达患者，差异有统计学意义（χ2=8.33，P<0.01）。XAF1 mRNA 阳性(XAF1+)患者缓解率为86.84%，明显高于XAF1 mRNA 阴性(XAF1-)患者（51.61％）（χ2=10.29，P<0.01）。XIAPlowXAF1+ 患者缓解率（92.00％）明显高于XIAPhighXAF1-患者缓解率（40.00％）(P<0.01)（表3）。Table 3. Relationship between expression of XIAP，XAF1 mRNA and complete remission rate of 69 newly diagnosed AL patients（略）
讨 论
XIAP又名为BIRC4，1996年由Duckett 等鉴定出来［5］。体外研究发现，XIAP对内源性和外源性凋亡途径均有抑制作用，是体内抑制caspase活性最强的蛋白。XAF1、Smac和HtrA2三者氨基末端序列相似。XAF1是一个新发现的核蛋白，Fong等［6］用FISH技术确定XAF1基因定位于11p13.2，编码含301个氨基酸残基的蛋白，含有7个锌指结构。Liston等［3］通过构建含XAF1和红色荧光蛋白的融合蛋白发现，XAF1主要以不同大小点状沿核内膜分布，XAF1通过扣留XIAP在核内降低胞质XIAP蛋白浓度而促进细胞凋亡。
Tamm等［7］分析了78例AML患者XIAP表达与临床效果关系，发现XIAP低表达患者生存时间和中位缓解期较高表达患者明显延长。蔡真等［4］利用RT-PCR检测骨髓增生异常综合征（MDS）患者骨髓标本XIAP表达，发现低危MDS患者表达水平低于正常人，高危MDS患者表达水平高于正常人。我们的研究发现，初治急性白血病患者XIAP mRNA表达水平明显高于正常对照，缓解期患者的表达水平较初治时明显降低，但仍高于正常对照，推测可能与微小残留病有关。复发急性白血病患者的表达水平高于缓解期患者，这提示XIAP在急性白血病发病和病情进展中起重要作用。XIAP高表达患者完全缓解率明显低于低表达患者缓解率，提示急性白血病高表达XIAP患者经诱导缓解治疗，其完全缓解率低，预后不良。
Smac是第一个发现的人含reaper样基序的线粒体蛋白，成熟Smac以同型二聚体形式拮抗包括XIAP在内的IAP家族多个成员对caspase的抑制［8］。HtrA2是丝氨酸蛋白酶家族的一个新成员，与大肠杆菌热休克蛋白HtrA及人HtrA1、HtrA3广泛同源，细胞受凋亡刺激时HtrA2从线粒体膜间隙释放入胞质，通过两个途径促进细胞凋亡： AVPS基序竞争性结合IAP多个成员，释放并激活多种caspase；更重要的是HtrA2通过AVPS基序结合IAP后水解剪切灭活IAPs［9］。Adrain等［10］研究发现，293T、Jurkat、CEM、HeLa等细胞株均表达Smac。本研究发现初治AL患者的Smac mRNA阳性率较正常对照高，这提示白血病细胞普遍存在Smac表达升高。Jia等［11］转染K562和CEM细胞株Smac基因，发现转染Smac基因可提高白血病细胞对凋亡刺激的敏感性并且抑制白血病细胞增殖，而本研究发现，初治AL患者的Smac阳性率明显高于正常对照，而且阳性表达的患者缓解率低于阴性患者。小鼠模型表明，mnd2(小鼠的HtrA2对应物)缺失导致小鼠肌萎缩、神经元退行性变及寿命缩短，这一结果提示HtrA2对于正常细胞的生存是必不可少的［12］。本研究发现，初治AL患者的HtrA2 mRNA表达水平较正常对照高。
Fong等［6］用定量PCR方法检测国立癌症研究所的60个癌细胞株，发现多数细胞株XAF1 低表达或无表达。正常胚胎及成人组织中广泛表达XAF1，而大多数癌细胞株低表达或无表达，这提示XAF1表达缺失参与肿瘤形成过程。微卫星分析上述60个癌细胞株XAF1基因位点发现存在多个多态性标记杂合性缺失。Byun等［13］研究胃癌组织及胃癌细胞株XAF1 mRNA表达发现，部分胃癌组织及细胞株无或极低水平表达，不表达的细胞株用5-氮杂脱氧胞苷处理后均表达XAF1 mRNA。Ng等［14］研究XAF1 mRNA在16个黑色素瘤细胞株中表达，发现9个细胞株无或极弱表达，6个细胞株中度表达，1个细胞株表达水平类似正常人表皮黑色素细胞。我们的研究发现，正常对照骨髓标本均表达XAF1 mRNA，初治AL患者的表达阳性率仅为56.32%，而且平均表达水平明显低于正常对照，缓解期患者的阳性表达率为78.26%，复发患者的阳性表达率仅为33.33%。NB4、K562、HL-60和KG-1a 4个白血病细胞株中仅HL-60低表达XAF1 mRNA。初治AL患者中XAF1阳性表达的患者完全缓解率明显高于表达阴性的患者。
上述研究表明，不仅多种癌细胞株、胃癌和黑色素瘤，而且急性白血病均存在XAF1 mRNA表达减低或缺失现象，XAF1表达降低与急性白血病发生与病情进展具有明显的相关性，这提示XAF1表达减低或缺失可能是急性白血病预后中的高危因素之一。急性白血病XAF1转录下调分子机制有待于进一步研究。
【】
1 Salvesen GS，Duckett CS. IAP proteins: blocking the road to death’s door. Nat Rev Mol Cell Biol，2002; 3: 401-410
2 Carter BZ，Milella M，Tsao T，et al. Regulation and targeting of antiapoptotic XIAP in acute myeloid leukemia. Leukemia，2003; 17: 2081-2089
3 Liston P，Fong WG，Kelly NL，et al. Identification of XAF1 as an antagonist of XIAP anti-Caspase activity. Nat Cell Biol，2001; 3: 128-133
4 蔡真，包悍英，Wolf-Dieter Ludwig等. survivin、XIAP在骨髓增生异常综合征患者及其细胞株MUTZ-1中的表达及意义. 中华血液学杂志，2004; 25: 26-30
5 Duckett CS，Nava VE，Gedrich RW，et al. A conserved family of cellular genes related to the baculovirus iap gene and encoding apoptosis inhibitors. EMBO J，1996; 15: 2685-2694
6 Fong WG，Liston P，Rajcan-Separovic E，et al. Expression and genetic analysis of XIAP-associated factor 1 (XAF1) in cancer cell lines. Genomics，2000; 70: 113-122
7 Tamm I，Kornblau SM，Segall H，et al. Expression and prognostic significance of IAP-family genes in human cancers and myeloid leukemias. Clin Cancer Res，2000; 6: 1796-1803
8 Du C，Fang M，Li Y，et al. Smac，a mitochondrial protein that promotes cytochrome c-dependent caspase activation by eliminating IAP inhibition. Cell，2000; 102: 33-42
9 Gray CW，Ward RV，Karran E，et al. Characterization of human HtrA2，a novel serine protease involved in the mammalian cellular stress response. Eur J Biochem，2000; 267: 5699-5710
10 Adrain C，Creagh EM，Martin SJ. Apoptosis-associated release of Smac/DIABLO from mitochondria requires active caspases and is blocked by Bcl-2. EMBO J，2001; 20: 6627-6636
11 Jia L，Patwaari Y，Kelsey SM，et al. Role of Smac in human leukaemic cell apoptosis and proliferation. Oncogene，2003; 22: 1589-1599
12 Jones JM，Datta P，Srinivasula SM，et al. Loss of Omi mitochondrial protease activity causes the neuromuscular disorder of mnd2 mutant mice. Nature，2003（6959）; 425: 721-727
13 Byun DS，Cho K，Ryu BK，et al. Hypermethylation of XIAP-associated factor 1，a putative tumor suppressor gene from the 17p13.2 locus，in human gastric adenocarcinomas. Cancer Res，2003; 63: 7068-7075
14 Ng KC，Campos EI，Martinka M，et al. XAF1 expression is significantly reduced in human melanoma. J Invest Dermatol，2004; 123: 1127-1134.
