硝普钠诱导K562细胞凋亡过程中STAT3/P38MAPK活化及端粒酶hTERT-mRNA表达的研究
作者：周永列，吕亚萍，吕火祥，邱莲女，王文松，林惠君，刘建栋
【摘要】 为了研究外源性一氧化氮供体硝普钠（SNP）诱导K562细胞凋亡过程中STAT3及P38MAPK活化及端粒酶hTERT-mRNA表达的变化，探讨硝普钠诱导K562细胞凋亡机制，用Annexin-V/PI双标记、DNA片段原位末端标记法、DNA凝胶电泳、DNA含量及细胞周期分析等方法检测细胞凋亡。用流式细胞术测定经硝普钠干预后K562细胞磷酸化P38MAPK和磷酸化STAT3的表达，同时利用实时荧光PCR定量检测端粒酶hTERT-mRNA表达的变化。结果表明： K562细胞经硝普钠作用后出现典型的细胞形态改变，DNA片段化，显现亚G1峰Ⅱ并显著增加。Annexin-V/PI和DNA片段原位末端标记表达增加。这些均证实NO能诱导K562细胞凋亡，大部分细胞阻滞于G0/G1期。SNP诱导K562细胞凋亡过程中，磷酸化P38MAPK和磷酸化STAT3的表达随SNP浓度的增加而表现为先增强后下降；K562细胞与2.0 mmol/L SNP孵育不同的时间内，磷酸化P38MAPK的表达在12小时时达到高峰并持续至48小时，72小时后表达下降；磷酸化STAT3的表达在24小时时达高峰，48小时后表达即显著下降；端粒酶hTERT-mRNA的表达随SNP作用的浓度增加和时间延长而显著下调。结论：SNP能诱导K562细胞凋亡，其机制可能与P38MAPK的活化、抑制端粒酶逆转录酶和STAT3的活化有关。
【关键词】 硝普钠；一氧化氮；K562细胞；细胞凋亡；STAT3；P38MAPK；端粒酶；hTERT-mRNA
Effects of Sodium Nitroprusside on P38MAPK/STAT3 Activation
and Telomerase Reverse Transcriptase mRNA Expression in
Inducing Apoptosis of K562 Cell Line
Abstract This study was aimed to investigate the activation of P38MAPK/STAT3 and expression of telomerase reverse transcriptase during sodium nitroprusside (SNP) inducing apoptosis of human leukemia cell line K562 and to explore the molecular mechanisms of SNP-inducing apoptosis in K562 cells. The K562 cell were treated with different concentrations of SNP and were cultured for different time. Cell apoptosis was analysed by cell morphology，DNA agarose gel electrophoresis， DNA content，and Annexin-V/PI labeling method. The TdT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) assay was used to quantitate the in situ cell apoptosis. The expressions of phosphorylated p38MAPK or STAT3 were analysed by flow cytometry，while the expression of hTERT mRNA in transcriptional level was measured by fluorescence quantitative RT-PCR. The results showed that SNP inhibited K562 cell growth. The K562 cell apoposis was comfirmed by typical cell morphology and DNA fragment，peak of sub-G1 phase，TUNEL and Annexin-Ⅴ/PI labeling. A majority of K562 cells were arrested in G0/G1 phase. After treatment with SNP at 0.5-3.0 mmol/L，the expression of phosphorylated-P38MAPK and phosphorylated-STAT3 increased first and decreased afterwards. Incubation of K562 cell with SNP (2 mmol/L) could increase the expression of phosphorylated-P38MAPK and phosphorylated-STAT3 at 12 hours and 24 hours respectively，and down-regulated at 72 hours and 48 hours. SNP could decrease the expression of hTERT-mRNA in time-and dose-dependent manner. It is concluded that SNP can significantly induce K562 cells apoptosis，its mechanism may be related to the activation of P38MAPK and suppression of phosphorylated-STAT3 and hTRET-mRNA.
Key words sodium nitroprusside; nitric oxide; K562 cell; apoptosis; STAT3; P38MAPK; telomerase; hTERT mRNA
有丝分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK) 信号通路参与了细胞生长、发育、分裂及细胞间的功能同步等生理过程和细胞恶性转化等病理过程。P38MAPK是MAPK家族的重要成员，可被多种因子和环境应激反应激活，介导细胞增殖、分化和凋亡［1］。STAT3是信号转导和转录活化因子（signal transducers and activators of transcription，Stats）家族中的重要成员，接受生长因子、细胞因子的刺激，调节细胞的生长、分化、恶性转化和凋亡［2，3］。端粒酶对于细胞的永生化、凋亡、恶性转化和衰老等起着重要作用，在绝大多数肿瘤细胞中端粒酶活性表达显著增加。以端粒酶作为靶点，抑制端粒酶活性可为临床治疗肿瘤提供一种新的策略［4］。生物体内的NO是一种反应极强的效应分子，也是体内发现的第一个气体信使分子。我们的前期研究已证实，用硝普钠（sodium nitroprusside，SNP）作为外源性的NO供体，可通过细胞阻滞于G0/G1期而显著抑制K562细胞的增殖并诱导K562细胞凋亡。本研究通过观察硝普钠诱导K562细胞凋亡过程中STAT3、P38MAPK及端粒酶hTERT-mRNA表达的变化，探讨硝普钠对白血病细胞作用的机制。
材料和方法
实验试剂
外源性NO供体硝普钠（SNP）、二甲亚砜、噻唑蓝（MTT）、蛋白酶K、多聚甲醛均为Sigma产品；DNA-Prepkit(内含透膜剂，RNase和PI)为美国Beckman-Coulter公司产品；Annexin-Ⅴ和PI试剂系法国Immunotech公司产品；TUNEL试剂盒购自Calbiochem公司。PE标记的磷酸化P38MAPK（T180/Y182）单克隆抗体（Clone:36）和磷酸化Stat3（Y705）单克隆抗体（Clone:4）购自BD Bioscience公司；hTERT-mRNA实时荧光定量PCR试剂盒由Roche公司提供。
细胞培养
K562细胞株由浙江大学医学院儿童血液病研究室汤永民教授惠赠。采用含10%灭活小牛血清的RPMI 1640培养液（Gibco公司产品）并加入羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）、青霉素100 U/ml，链霉素100 μg/ml的培养体系，在5%的CO2、饱和湿度下37℃的培养箱中悬浮培养，2-3天换液1次，取对数生长期的细胞进行实验。
K562细胞增殖抑制的MTT测定
将对数生长期的K562细胞调整细胞浓度为5×104，接种于96孔无菌培养板中，每孔200 μl。实验组设4种不同浓度(0.5、1.0、2.0、3.0 mmol/L)的SNP，每组每个浓度下设3个复孔，培养24、48和72小时后加10 μl MTT(10 mg/ml)，继续培养4小时后离心弃上清液，每孔加入200 μl DMSO终止反应，微振荡后，用全自动酶标仪在570 nm波长处读取吸光度（A）值。增殖抑制率，公式为抑制率（%）=（A对照-A实验/A对照-A空白）×100%
SNP诱导K562细胞凋亡作用的检测
Annexin V/PI测定 SNP与K562细胞置于5% CO2的培养箱中在37℃孵育24小时，轻轻收获细胞1×106个，用冷PBS洗1遍后置0℃水浴中，加490 μl结合缓冲液，轻轻地混匀细胞后加入5 μl FITC-Annexin V和5 μl PI，10分钟后用流式细胞仪检测。
细胞DNA亚二倍体测定
取SNP与K562作用的培养细胞悬液0.5 ml，用冷PBS洗涤1次，加DNA-Prepkit中的透膜液50 μl，轻摇后放置1分钟，加碘化丙锭染液500 μl作用15分钟后，在EPICS-XL型流式细胞仪（Beckman-Coluter产品）上进行分析，用Muticycle 软件进行DNA倍体及细胞周期分析，计算亚二倍体峰 (sub G1)的百分率。
TUNEL测定
将SNP与K562培养48小时后的细胞涂片用4%多聚甲醛室温下固定15分钟，再用80%乙醇固定5分钟。用TBS水化15分钟，加细胞透膜液（内含0.1%的Trinton X-100，1 g/L的枸橼酸钠），室温放置5分钟后用甲醇-双氧水除内源性过氧化物酶。加入50 μl DNA末端反应液(以不加TdT酶溶液的反应溶液用作实验本底对照)，置37℃水浴90分钟。用TBS洗涤2次后加碱性磷酸酶标记物37℃孵育30分钟，用TBS洗涤3次后用底物显色，再用甲基绿复染，光学显微镜下高倍视野计数500个细胞。以细胞内有淡黄色至棕黄色颗粒的为凋亡细胞，计算凋亡率。
凋亡率(%)=（凋亡细胞数/总细胞数）×100%
DNA Ladder分析
取SNP与K562共同培养72小时后的细胞约1×107个细胞，用酚-氯仿提取DNA，复溶于TE缓冲液中，经溴乙锭（0.5 μg/ml）染色后，用15 g/L琼脂糖凝胶电泳，5 V/cm，电泳3-4小时，在紫外线透射仪上显影拍照。
磷酸化P38MAPK和磷酸化STAT3表达的检测
实验分组同上。收集经SNP处理后的K562细胞，用PBS液洗1次，并调整细胞浓度约为106/ml。用2%多聚甲醛/PBS溶液于37℃固定10分钟，离心后弃上层液；用90%的甲醇作细胞透膜，冰浴30分钟；再用PBS洗细胞2次。经上述处理后的细胞悬液各100 μl分别用PE标记的磷酸化P38MAPK单克隆抗体和磷酸化STAT3单克隆抗体20 μl染色，室温避光放置60分钟后在流式细胞仪上分析。
hTERT-mRNA表达的实时荧光定量RT-PCR检测
实验分组同上。以TRIzoL一步法按说明书提取各组细胞总RNA。检测时设加逆转录酶的测定管，不加逆转录酶的空白管和以PBGD为内参照的对照管，每批检测时同时测定hTERT-mRNR和PBGD的阴、阳性对照及标准曲线。PCR反应体系为20 μl，内含有10×反应缓冲液2 μl，逆转录酶0.1 μl，10×hTERT或PBGD反应测定液2 μl，PCR级蒸馏水13.9 μl，RNA提取物2 μl。按试剂盒说明书在LightCycler荧光PCR仪上设置反应程序。检测结果以（测定管-空白管）/内对照管的比值表示。
结 果
SNP对K562细胞增殖抑制作用的影响
K562细胞经SNP作用后，随着药物浓度的增加，细胞增殖率明显受抑，细胞活率也显著减少，0.5 mmol/L SNP即可显著抑制K562细胞生长；且随着药物作用时间的延长，SNP的抑制效率也明显增加，24、48和72小时的半数抑制浓度（IC50）分别约为3.0、2.3、1.2 mmol/L（图1）。
SNP诱导K562细胞凋亡作用的观察
K562细胞经不同浓度的SNP培养24小时之后，Annexin V+/PI-表达显著增高;孵育48小时后，TUNEL法检测细胞凋亡率也明显升高;两者结果与SNP浓度存在一定的剂量依赖效应。细胞周期及DNA倍体分析也表明，SNP诱导K562细胞的凋亡率存在着时间和浓度的量效关系。随着作用时间的延长和药物浓度的增加，亚G1期百分率也随之增加，显著高于对照组（附表）。K562细胞经SNP培养48小时，细胞周期进程明显受影响，G0/G1期细胞增加，同时S期细胞百分比显著减少；作用72小时后，这种效应有所减弱。K562细胞与不同浓度的SNP孵育72小时后，DNA琼脂糖凝胶电泳检测可见清晰的凋亡细胞特征性的梯状条带(图2-4)。
SNP诱导K562细胞凋亡过程中磷酸化P38MAPK和磷酸化STAT3表达的变化
检测结果显示： K562细胞经0.5、1.0、2.0、3.0 mmol/L的SNP共同培养后，磷酸化P38MAPK和磷酸化STAT3随SNP浓度增加而表达增强，至2.0 mmol/L时表达最强，3.0 mmol/L时磷酸化P38MAPK和磷酸化STAT3又降至0.5 mmol/L时的表达水平(图5)。K562细胞与2.0 mmol/L的SNP孵育不同的时间，磷酸化P38MAPK的表达在12小时时达到高峰，24和48小时时的表达维持在高峰平台期，至72小时后表达显著下降，接近空白对照组。磷酸化STAT3的表达在12小时显著增加，24小时时最高，48小时后表达下降，低于12小时时的表达(图6)。
SNP对K562细胞hTERT-mRNA表达的影响
K562细胞经0.5、1.0、2.0、3.0 mmol/L的SNP共同培养48 小时后，hTERT-mRNA 表达水平逐渐下降，hTERT/PBGD的比值依次为23.7、17.3、10.1、7.2，空白对照为24.5，K562细胞与2.0 mmol/L的SNP孵育24、48、72小时，hTERT-mRNA表达水平也随培养时间延长而降低，其比值依次为17.9、13.3、4.3。Table. Apoptosis of K562 cells after treatment with different concentrations of SNP（略）
讨 论
NO是具有多种效应的重要生物信使分子，也是一种极其活跃的生物活性物质。生物体内的NO作为一种反应极强的自由剂，兼具第二信使和神经递质作用。近年来的研究表明，NO参与了造血调控，影响造血细胞的生长、分化和凋亡。我们此前的研究表明，SNP在体外对K562细胞具有生长抑制、细胞周期阻滞及诱导凋亡作用，且呈浓度和时间依赖性。该效应作用的分子机制与线粒体膜电位降低、细胞内活性氧自由剂增加、bcl-2表达下调、bax和bad表达上调以及P53和Fas表达增加有关。
MAPK是细胞内重要的信号转导系统，其中P38MAPK信号通路是一个由应激事件引起的信号转导主要途径，通常被紫外线、渗透压变化、细胞因子和各种生理应激等各种环境刺激而激活。近年来的研究还发现，P38MAPK的表达和活性的变化可以有效地调节和阻断关键的信号通路，调控细胞凋亡。P38MAPK磷酸化后可激活P53蛋白NH2端的33位丝氨酸，阻断P38MAPK磷酸化可以抑制P53基因的转录激活［5］。Ghatan等［6］用SNP诱导神经母细胞瘤和原始皮质神经细胞凋亡过程中，发现P38MAPK被激活，导致bax从胞质向线粒体转移，进而引起细胞凋亡。P38MAPK的激活在这一过程中发挥了关键作用。本研究结果显示，K562细胞经SNP作用后出现典型的细胞形态改变、DNA片段化、亚G1峰显现并显著增加；Annexin V/PI和DNA片段原位末端标记表达增加等均证实NO能诱导K562细胞凋亡。在此过程中，我们用流式细胞仪检测了K562细胞经不同浓度SNP和不同培养时间处理后P38MAPK的表达变化，发现磷酸化P38MAPK随SNP浓度增加而表达增强，至2.0 mmol/L时表达最强，3.0 mmol/L时磷酸化P38MAPK表达又降至0.5 mmol/L时的水平。K562细胞与2.0 mmol/L的SNP孵育不同的时间，磷酸化P38MAPK的表达在12小时时达到高峰，24和48小时时的表达维持在高峰平台期，至72小时后表达显著下降，接近空白对照组。该变化与我们此前研究SNP诱导K562细胞凋亡作用中bcl-2表达下调、bax和bad表达上调及P53和Fas表达增加的基本一致，这说明P38MAPK的活化参与了SNP诱导K562细胞的凋亡。
STAT3主要有STAT3α和STAT3β两种亚型，其中STAT3α的C-末端Y701和Y705的两个酪氨酸可发生磷酸化，Y705是发生酪氨酸磷酸化的主要位点。STAT3在酪氨酸磷酸化后可获得与DNA结合的能力，激活靶基因的转录，这是STAT3活化的标志。近几年的研究已证实STAT3的异常活化与血液病和肿瘤的发生密切相关［7］。STAT3具有加速细胞循环周期、促进细胞转化、抑制凋亡的作用。本研究检测了K562细胞经不同浓度SNP和不同培养时间处理后磷酸化STAT3的表达变化，结果显示磷酸化STAT3随SNP浓度增加而表达增强，至2.0 mmol/L时表达最强，3.0 mmol/L时磷酸化STAT3又降至0.5 mmol/L时的表达水平。K562细胞与2.0mmol/L的SNP孵育不同的时间，磷酸化STAT3的表达在12小时显著增加，24小时时最高，48小时后表达下降，低于12小时时的表达水平。磷酸化STAT3表达的这一规律可能是SNP一过性的激活JAK-STAT途径，但随NSP作用剂量和时间的增加，磷酸化STAT3的表达还是呈下降趋势。肿瘤细胞内持续激活STAT3具有阻断凋亡的作用［8］，STAT3活性增强抑制Fas介导的凋亡和诱导bcl-2激活的抗凋亡作用［9］。P38MAPK的磷酸化也可激活STAT3，本研究p38MAPK和STAT3的变化趋势也可能与此有关，提示STAT3的活化在SNP诱导K562细胞凋亡过程中发挥了重要作用。
近年来的许多研究已证实，大多数的恶性肿瘤和白血病高表达端粒酶活性［10］。因此，以端粒酶为靶点已成为抗肿瘤的研究热点。现已知端粒酶有RNA模板hTR、逆转录酶hTERT和端粒酶相关蛋白1三种组分，其中hTERT作为端粒酶的催化亚单位，被认为是端粒酶的主要功能单位，与肿瘤细胞永生化的关系最密切。本研究用荧光实时定量RT-PCR检测了SNP诱导K562细胞凋亡过程中hTERT-mRNA的变化规律，发现随SNP作用时间和浓度增加，K562细胞凋亡也显著增加的同时，hTERT-mRNA的表达水平呈明显下降趋势，表现为时间和浓度的量效关系。我们推测NO也可以通过抑制端粒酶活性使K562细胞发生凋亡，端粒酶可能是NO抗肿瘤的治疗靶点之一。
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