血管紧张素Ⅱ对脐血CD34+细胞体外分化为巨核细胞的影响
作者：戴兵，何吉，陈舒，刘晋辉，秦斐，朱发明，严力行
【摘要】 为了探讨血管紧张素Ⅱ对脐血CD34+细胞诱导分化为巨核细胞的影响，采用免疫磁珠法(MACS)分选8例健康产妇足月顺产胎儿脐血中的CD34+细胞，在含血小板生成素（TPO 50 ng/ml）、白介素-3（IL-3 10 ng/ml）、干细胞刺激因子（SCF 50 ng/ml）的无血清培养液中添加浓度分别为50、100、1 000 μg/ml的血管紧张素Ⅱ作为实验组；同时以未添加血管紧张素Ⅱ的基础培养液作为对照组，培养14天后观察结果。细胞计数仪计数单个核细胞数（MNC）；流式细胞仪计数培养体系中的CD41+细胞数、血小板数，及分析细胞周期；利用CD41单克隆抗体免疫荧光染色观察培养体系中的细胞情况。结果表明： 与对照组比较，实验组单个核细胞数无明显改变（P>0.05）；而CD41+细胞和血小板数量有明显的增加(P<0.05)；细胞周期分析显示，实验组的4倍体细胞增加，并存在明显的凋亡(P<0.05)；荧光显微镜下观察对照组和实验组均可见大小不一的CD41+细胞。结论： 血管紧张素Ⅱ可以促进脐血中CD34+细胞诱导分化为巨核细胞，并能促进巨核细胞产生血小板。
【关键词】 血管紧张素Ⅱ；CD34+细胞；巨核细胞；脐血
Effect of Angiotensin Ⅱ on Differentiation of Umbilical Cord Blood CD34+ Cells into Megakaryocytes
Abstract This study was aimed to investigate the effect of angiotensin Ⅱon differentiation of cord blood CD34+ cells into megakaryocytes in vitro. The CD34+ cells from eight fresh umbilical cord blood samples sorted by a high-gradient magnetic cell sorting system (MACS) were cultured in serum-free culture medium containing thrombopoietin (TPO) 50 ng/ml，IL-3 10 ng/ml，stem cell factor (SCF) 50 ng/ml and different concentrations of angiotensinⅡ(0，50，100，1000 μg/ml) for 14 days. Mononuclear cells (MNC) were counted by automatic cell analyzer. Cultured CD41+ cell and platelet counts in cultured system，and cell cycle were analyzed by flow cytometry. CD41 specific monoclonal antibody staining was observed by immunofluorescence microscopy. The results showed that as compared with the control group，the number of MNC not increased significantly（P>0.05），but the number of CD41+ cells and platelets increased significantly in treatment group (P<0.05). Cell cycle analysis revealed that the amounts of 4N cells increased and apoptosis cells obviously existed in treatment group (P<0.05). After fluorescence staining，more CD41+ cells of different sizes were observed by means of fluorescence microscopy in both groups. It is concluded that angiotensinⅡ can induce the cord blood CD34+ cells to differentiate towards megakaryocyte，and enhance the function of megakaryocyte to produce platelet.
Key words angiotensinⅡ； CD34+ cell； megakaryocyte； umbilical cord blood
血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）是肾素血管紧张素系统的一种主要活性物质，其生物学作用主要是调节机体内水、电解质和血压的平衡，但许多临床和体外实验结果提示，AngⅡ可能参与调控造血细胞的生长。国内外部分学者研究了AngⅡ对红系造血的影响［1-4］，但AngⅡ对巨核系的作用尚不清楚。在本实验中我们采用无血清培养体系体外诱导CD34+细胞扩增，探讨AngⅡ对脐血CD34+细胞诱导分化为巨核细胞和血小板生成的影响。
接受材料和方法
主要试剂
AngⅡ（AnaSpec，Inc.产品）5 mg溶解于1ml的灭菌双蒸水中，浓度为5 mg/ml；CD34(8G12)-PE、 CD41a-FITC、CD61-PerCP和细胞周期分析试剂(CycleTEST Plus DNA Reagent Kit)购自美国Bacton Dickinson公司；无血清培养液（StemSpanTMSFEM）、血小板生成素（TPO）、白介素-3（IL-3）、干细胞因子（SCF）购自加拿大Stem Cell公司。
脐血的采集和单个核细胞分离
选择正常分娩的健康产妇8名，征得其同意后于足月顺产的胎儿娩出后立即断脐，消毒脐带表面，行脐静脉穿刺，用ACD-B三联袋（山东威高集团产品）采集脐血。采用淋巴细胞分离液分离单个核细胞（MNC），从标本采集到处理不超过12小时。
CD34+细胞的分选
采用吸附单克隆抗体-磁珠分离系统（MACS，德国Miltenyi公司产品）分离富集CD34+细胞，分离后的CD34+细胞在流式细胞仪（FACS Calibur，美国Becton Dickinson公司产品）上检测其纯度为86％-91％。
CD34+细胞体外诱导培养
在StemSpanTMSFEM无血清培养液中加入TPO 50 ng/ml、IL-3 10 ng/ml、SCF 50 ng/ml作为基础培养体系（对照组）。在上述基础培养体系中分别添加终浓度为50、100、1 000 μg/ml的AngⅡ作为试验组。调整CD34+细胞终浓度为1×105/ml，接种在24孔板上，每孔1 ml，在37℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养14天。
MNC计数
培养14天后的细胞，采用细胞计数仪（雅培Cell-Dyn1700）检测其MNC数。
CD34+细胞、CD41+细胞检测及细胞周期分析
培养14天后的细胞，用流式细胞仪分别检测其CD34+细胞、CD41+细胞和分析细胞周期，操作均严格按试剂说明书进行。
培养细胞荧光染色
培养14天后的细胞，经离心洗涤后涂片、甲醛固定。在涂片上滴加FITC（250 μg/ml）标记的抗CD41单克隆抗体，37℃孵育30分钟，洗涤印干，立即在荧光显微镜下观察结果。
血小板的检测
血小板为CD41+细胞，其体积远小于巨核细胞，胞内所含颗粒比普通细胞少。根据此特性在流式细胞仪上利用侧向角（SSC）观察血小板。
统计学处理
采用SPSS 12.0统计软件包处理数据。数据结果以X±SD表示，组间计量资料比较采用t检验。
结果
不同浓度AngⅡ对脐血CD34+细胞培养后MNC和CD41+细胞数的影响
结果显示，实验组和对照组CD41+细胞数均增加，但各AngⅡ浓度实验组的CD41+细胞数均明显高于对照组（P<0.05）（表1），培养后各组的MNC总数无显著性差异（P＞0.05）。Table 1. Effect of AngⅡ in different concentrations on number of MNC and CD41+ cells (略)
AngⅡ对脐血CD34+细胞培养后细胞周期的影响
采用流式细胞仪分析细胞周期。结果显示，对照组大多为2倍体细胞，存在少量的4倍体细胞；而实验组G2/M期细胞比例明显增加（表2），同时可见明显亚二倍体峰和4倍体细胞峰。Table 2. Analysis of cell cycle by flow cytometry（％）(略)
培养后细胞抗CD41单克隆抗体荧光染色结果
荧光显微镜下可见部分细胞的胞膜上显示清晰的绿色荧光，细胞体积大小不一（2-5 μm、10-15 μm），圆形或椭圆形。这提示培养后的细胞中含有巨核细胞和血小板（图1）。Figure 1. Fluorescence staining of treated cells in culture by anti-human CD41-FITC antibody .(×400).
AngⅡ对脐血CD34+细胞培养14天后血小板生成量的影响
用正常成人外周血液中富集得到的血小板校准仪器后，在流式细胞仪上分析培养14天后的细胞可见实验组血小板峰明显高于对照组（图2）。
讨 论
近年来发现，巨核祖细胞体外扩增获得的巨核细胞输注到病人体内后，能在体内进一步发育并形成血小板，加速病人血小板的恢复，缩短血小板缺乏期［5］。因此系统研究体外造血细胞向巨核系定向诱导分化和扩增具有重要的意义，它将为化疗或移植后的血小板减少症提供一个可能的途径。
现有研究表明，体外巨核祖细胞的扩增和分化受多种细胞因子的调节［6，7］，其中最关键的因子是TPO，本实验室和其他作者曾证实GM-CSF可促进巨核细胞的生长分化［8］。由于参与造血调控的因素较多，近年来研究者开始关注机体其他系统的生物活性因子对造血系统的影响。Rodgers等［1］报道，AngⅡ可以刺激早期干细胞的增殖，并诱导其向原始红细胞分化。黎纬明等［3］发现，AngⅡ对CD34+细胞阶段的造血干/祖细胞无直接的生长调节作用，但在造血干/祖细胞生长分化的过程中，可刺激CFU-GM和BFU-E的增生。彭程等［4］发现AngⅡ可刺激CFU－GM 和其进一步分化细胞的扩增。本实验在TPO、IL-3、SCF因子组合的基础上观察AngⅡ对脐血CD34+细诱导分化成巨核细胞的作用。结果表明，AngⅡ可以促进脐血中CD34+细胞诱导分化为巨核细胞，并能加强巨核细胞的成熟，促进巨核细胞产生血小板。
CD41分子是巨核细胞和血小板的特异性表面标志，本实验中我们利用其鉴定巨核细胞和血小板，结果显示实验组CD41+细胞数明显增加，在免疫荧光显微镜下也可见巨核细胞和血小板。巨核系只有在祖细胞阶段才能进行扩增从而使巨核细胞数量增加，提示AngⅡ必然直接作用于巨核祖细胞，才能使巨核细胞增加，并促进巨核细胞的成熟。Stephane等［9］报道，半胱天冬酶调节的细胞凋亡与巨核细胞产生血小板有非常密切的联系，本实验也发现在AngⅡ的作用下，培养后的细胞出现明显的亚二倍体峰，提示细胞的凋亡可能与AngⅡ促进巨核细胞产生血小板有关。此外，巨核细胞的核内复制是巨核细胞走向成熟的过程，与血小板的产生也密切相关［10］，2倍体巨核细胞不产生血小板，只有多倍体巨核细胞才具备产生血小板的功能。从16倍体到32或64倍体的过程是巨核细胞趋于成熟的过程，由于观察时间不够或需要追加其他刺激巨核系成熟的因子等原因，本实验的培养体系中只观察到4倍体细胞，未能检测到16倍体、32倍体的成熟巨核细胞，如何在体外获取大量的趋多倍体成熟巨核细胞仍有待于进一步研究。
AngⅡ的主要生物学效应是通过受体介导的，包括收缩血管、升高血压、刺激肾上腺皮质分泌醛固酮、促进细胞增殖等，但AngⅡ诱导CD34+细胞分化为巨核细胞是否也通过受体介导尚不明确。同时本实验的结果进一步表明AngⅡ也参与造血调控，提示造血调控是一个涉及多个系统、多种因素综合作用的结果，在临床上应注意到AngⅡ相关药物在造血系统中可能产生的作用。
【】
1 Rodgers KE，Xiong S，Steer R，et al. Effect of angiotensinⅡ on hematopoietic cell proliferation. Stem cells，2000;18: 287-294
2 Mrug M，Stopka T，Julian BA，et al. AngiotensinⅡ stimulates proliferation of normal early erythroid progenitors. J Clin Invest，1997;100: 2310-2314
3 黎纬明，彭程，李爱香等.血管紧张素Ⅱ对定向造血祖细胞BFU-E体外扩增的影响.临床血液学杂志，2003; 5: 230-232
4 彭程，李纬民，马艳萍等.血管紧张素Ⅱ对脐血CD34+细胞体外扩增的作用.实验血液学杂志，2003;11: 227-229
5 Bruno S，Gunetti M，Gammaitoni L，et al. In vitro and in vivo megakaryocyte differentiation of fresh and ex-vivo expanded cord blood cells: rapid and transient megakaryocyte reconstitution. Haematologica，2003;88:379-387
6 Kie JH，Yang WI，Lee MK，et al. Decrease in apoptosis and increase in polyploidization of megakaryocytes by stem cell factor during ex vivo expansion of human cord blood CD34+ cells using thrombopoietin. Stem Cells，2002; 20: 73-79
7 Kim JA，Jung YJ，Seoh JY，et al. Gene expression profile of megakaryocytes from human cord blood CD34+ cells ex vivo expanded by thrombopoietin. Stem Cells，2002; 20: 402-416
8 蔡海波，康自珍，孙淑惠等.GM-CSF体外促进多倍体巨核细胞的生成.华东理工大学学报，2003; 29: 363-366
9 De Botton S，Sabri S，Daugas E，et al. Platelet formation is the consequence of caspase activation within megakaryocytes. Blood，2002; 100: 1310-1317
10 Mattia G，Vulcano F，Milazzo L，et al. Different ploidy levels of megakaryocytes generated from peripheral or cord blood CD34+ cells are correlated with different levels of platelet release. Blood，2002; 99: 888-897.
