无血清体外培养树突状细胞的研究
作者：张怀东，宋振岚,李伟平
【摘要】 本研究的目的是建立对外周血来源的树突状细胞(dendritic cell , DC)的无血清培养方案。以含胎牛血清(FCS)、人AB血清的培养液作为对照。分离健康志愿者外周血单个核细胞（PBMNC），在不同培养液中分别加入GM-CSF（100 ng/ml）、IL-4（500 U/ml）培养6天，再分别加入钙离子载体A23187（100 ng/ml）继续培养24小时，于倒置显微镜下观察细胞形态，流式细胞术分析细胞表型，MTT比色法检测各组DC刺激同种异体外周血T细胞增殖的能力和DC刺激的T 细胞对K562细胞的杀伤作用。结果表明：无血清培养组培养出典型形态的DC，其表面CD14分子的表达明显减少，CD83、HLA-DR、CDw123分子的表达明显增高，具有明显的刺激同种异体T细胞增殖的能力和DC刺激的T 细胞对K562细胞的杀伤作用。无血清组与两个含血清的对照组比较，组间无显著性差异（P>0.05）。结论：无血清培养液培养的DC与含血清的培养液培养的DC相比，无显著性差异。DC无血清培养具有临床应用前景。
【关键词】 树突状细胞；无血清培养液；钙离子载体；外周血
In Vitro Cultivation of Dendritic Cells with Serum-free Medium
AbstractThis study was aimed to investigate the protocol in vitro to incubate the dendritic cell (DC) derived from peripheral blood monocytes using serum-free medium X-VIVO 20. Peripheral blood monocytes from healthy donors were treated with 100 ng/ml GM-CSF and 500 U/ml IL-4, respectively. After cultivation for 6 days, they were treated with 100 ng/ml calcium ionophore A23187. After cultivation for 24 hours the cellular morphology was observed under invert microscope, the surface markers were analyzed by flow cytometry, the proliferation of allogenetic T cells was detected by MTT colorimetry, the specific cytotoxicity of T cells primed with DC was examined by MTT assay. The results showed that in all three groups with serum-free, fetal calf serum (FCS) and human AB serum mediums, cells displayed characteristic morphological features of DC. Simultaneously CD14 expression was decreased, and CD83, HLA-DR and CDw123 expression were increased on these cells. In addition, DCs cultured with these methods could evidently stimulate the proliferation of allogenetic T cell. As compared with the two controls of serum containing groups, the cultured cells in the serum-free groups showed almost the same allo-stimulatory capability and cellular morphology and surface markers, and T lymphocytes primed with the culture-derived DC exhibited the similar killing activity to K562 (P>0.05). It is concluded that there is no significance in DC numbers, morphology, epitope and ability to stimulate the proliferation of allogenetic T cells between DC induced by serum-free X-VIVO 20 medium and DC induced by serum-contained medium. DC cultured and induced by serum-free medium is worth using in practice widely.
Key wordsdendritic cell; serum-free medium; calcium ionophore; peripheral blood
树突状细胞是Steinman 和Cohn 于1973 年首先报道的,因其成熟时有树突样或伪足样突起而得名［1］。它源于造血干细胞,广泛分布于淋巴组织和非淋巴组织中,是机体内功能最强的抗原呈递细胞(antigen-presenting cells, APC)［2］，其最大的特点是能够显著刺激初始型T细胞增殖,是机体免疫反应的始动者。目前，多数体外培养液包含胎牛血清、混合人(AB型)血清或自体血清,由于血清中包含个体差异性的生长因子,异体血清又有外来抗原及危险感染侵入的弊端,人自体血清中又含有某些抑制DC生长的因子，这将使DC的临床应用受到限制。本实验采用无血清培养液X-VIVO 20则避免了上述缺点。本实验通过比较X-VIVO 20与含FCS、人AB血清的培养基对体外诱导扩增DC的影响，为进
一步优化无血清培养液条件，使DC疗法应用于临床提供实验依据。
材料和方法
材料
淋巴细胞分离液（Ficoll，密度1.077）购于上海华精生物高科技有限公司，rhGM-CSF购于华北制药集团金坦生物技术开发有限公司，rhIL-4、人血白蛋白、四甲基偶氮唑盐（MMT）、钙离子载体A23187均为Sigma公司产品，人AB血清（大连市中心血站产品），胎牛血清（民海生物工程有限公司产品），无血清培养液(Cambrex公司X-VIVO 20培养液) ，FITC标记的鼠抗人CD83、HLA-DR单克隆抗体和PE标记的鼠抗人CDw123、CD14单克隆抗体(Becton Dickinson公司产品)。
分组
根据培养液的不同分为以下4组。A组：含10％人AB血清的RPMI 1640；B组：含10％胎牛血清的RPMI 1640；C组：无血清培养液X-VIVO 20；D组：含20g/L人血白蛋白的X-VIVO 20。
DC的诱导
静脉采集正常人外周血，用淋巴细胞分离液分离获得外周血单个核细胞，分别用含10％人AB血清的RPMI 1640、含10％FCS的RPMI 1640、无血清培养基X-VIVO 20,将细胞稀释至3×106/ml，加入24孔培养板（1ml/well）中，于37℃、5％ CO2孵箱中培养2小时，轻轻洗出悬浮细胞，在培养板中分别加入含GM-CSF（100 ng/ml）、IL-4（500 U/ml）的4组不同培养液，37℃、5％CO2孵箱中培养，3天半量换液1次。在培养的第6天，每组分别加入钙离子载体A23187（100 ng/ml）继续培养24小时，收集细胞。
DC的形态学观察
用倒置显微镜每日观察细胞生长及形态变化情况，第3、7天作细胞计数，第7天作瑞氏—姬姆萨染色，观察摄片。
DC的表型分析
收集培养7天后的细胞，通过流式细胞术分析细胞表型——CD14、CDw123、CD83、HLA-DR。
混合淋巴细胞反应（MLR）
将正常人外周血单个核细胞接种于含10％人AB血清的RPMI 1640培液基中，在37℃、5％ CO2孵箱中培养2小时，取悬浮细胞为同种异体T淋巴细胞，调整细胞浓度为1×106/ml。将收集的DC悬液，加入丝裂霉素C 25 μg/ml，37℃孵育30分钟，RPMI1640培养液洗涤3次，用含10％人AB血清的RPMI 1640培养液悬浮，作为刺激细胞，分别以1×104/well、5×103/well、2.5×103/well、1.25×103/well加入96孔平底培养板，每组设2个复孔，再加入1×105/well同种异体T淋巴细胞，终体积为200 μl/well（DC与T淋巴细胞比例分别为1∶10、1∶20、1∶40、1∶80），另取3孔只加T淋巴细胞而不加DC，作为背景对照。37℃、5％ CO2孵箱中培养3天后，每孔加入MTT（5 mg/ml，20 μl/well），再继续孵育4小时，终止培养， 40×g离心5分钟，弃上清，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150 μl，振荡10分钟，用酶标仪检测波长570 nm时的吸光度（A）值，结果取平均值。刺激指数（SI）， SI=A实验组/A对照组。
K562细胞冻融抗原的制备
取K562细胞悬液20 ml,以生理盐水洗涤细胞2次后计数, 用无菌生理盐水配制细胞浓度为5×107/ml 的细胞悬液共2 ml,放入液氮中,10分钟后迅速放入37℃水浴中,待其完全融化后, 再次放入液氮中,反复冻融3次后,以360×g离心10分钟，取上清，用微孔滤膜过滤,即为K562细胞冻融抗原，4℃保存备用。
DC刺激的T细胞对K562细胞的杀伤作用
按上述方法培养DC（在培养第4天的DC中加入100 μl K562细胞冻融抗原）。用RPMI 1640培养液调整DC、同种异体T淋巴细胞浓度分别为1×105/ml、1×106/ml。各取DC和T淋巴细胞100 μl，加入96孔培养板共培养，对照组以100 μl RPMI1640培养液代替DC,37℃、5% CO2培养72 小时后,加入K562细胞作为靶细胞,效∶靶=10∶1,设3个复孔。37℃、5 % CO2 孵育48小时后弃悬液,每孔加入20 μl MTT 溶液(5 mg/ml),37℃、5% CO2 孵育4小时,终止培养, 40×g离心5分钟，弃上清,每孔加入二甲亚砜溶液150 μl,振荡10分钟 ，在酶标仪上测定各组在570 nm 处A值(结果用3 孔均值表示),并计算其杀伤率(%)。公式为:
细胞杀伤率(%)=［(效应细胞孔的A值+单纯靶细胞孔的A值-细胞毒实验孔的A值)/单纯靶细胞孔的A值］×100%
统计学处理
实验重复3次，所有数据以X±SD表示，采用样本均数的t检验，P>0.05为无统计学差异。所有统计学处理均用统计软件SPSS 12.0 for Windows 完成。
结果
活细胞的形态变化
倒置显微镜下显示，最初接种的细胞为大小均等的小圆细胞，细胞表面光滑，无或仅有少数细胞集聚成簇的现象。第3天,可见细胞形态明显改变,体积略增大，胞体出现树突状小突起，到第7天，各组均可见形态变为大圆形或不规则形等、具有典型的树枝状突起结构的细胞，有细胞集聚成簇的现象，部分细胞脱壁悬浮。体外培养第7天,瑞氏-姬姆萨染色,各组均可见细胞体积增大，表面粗糙，核呈圆形、肾形、马蹄形、椭圆形等，偏位，嗜碱性染色, 胞质丰富,胞膜向外伸展，形成大量形状、粗细不等的毛刺状突起，细胞突起和胞浆呈嗜酸性染色，表现为典型的DC形态（图1）。
细胞计数
细胞计数结果见表1，由表1可见随着培养时间的延长，各组DC细胞数量均增加，不同组间DC细胞数量无显著性差异（P>0.05）。Table 1. Amount of DC induced from peripheral human blood in different culture medium（略）
DC的表型分析
未处理的PBMNC 表面单核细胞的标志CD14分子呈高表达状态,而CDw123、HLA-DR及CD83分子的表达很弱或缺乏。培养后各组均出现成熟DC的特征性表面标志CD83分子表达增高, HLA-DR、CDw123分子的表达也明显增高, 而CD14分子的表达明显减少。无血清培养基组与含血清培养基组表达相差不大，加入20 g/L人血白蛋白无明显提高（表2）。不同组间差异无显著性（P>0.05）。Table 2. Phenotype analysis of the DC induced from peripheral human blood in different culture medium analyzed by flow cytometry（略）
各组DC刺激同种异体混合淋巴细胞反应的能力
采用不同培养液的各组DC在体外均能有效地激发同种异体外周血T细胞的增殖。D组的刺激指数比其他组略高，但不同组间差异无显著性（P>0.05）（表3）。Table 3. Stimulation index of each groups measured by MTT method （略）
DC刺激的T 细胞对K562细胞的杀伤作用
T细胞经DC刺激后对K562细胞的杀伤率，各组均较以100 μl RPMI 1640代替DC的对照组显著增高（P均<0.01）,有显著差异，说明经体外诱导的DC负载肿瘤抗原后,各组均可诱导肿瘤特异性T 细胞的产生,并杀伤K562肿瘤细胞。DC激活后的T细胞与K562细胞作用，各组之间差距不大（P均>0.05），无显著性差异（表4）。Table 4. Killing ratio of T cells stimulated by DC of each groups to K563 cells analyzed by MTT method (略)
讨论
目前无论化疗或造血干细胞移植白血病，都存在残留白血病细胞即微小残留病(MRD)的问题，使相当一部分患者因复发或难治而死亡。因此，如何有效清除体内MRD，有着极为重要的意义。树突状细胞（DC）可以使CTL最大限度地发挥特异性抗肿瘤效应，它能把肿瘤抗原有效地呈递给T细胞,使T细胞致敏,在肿瘤免疫治疗中起关键作用,这是一个理想的体内外消除MRD的方法。体外培养DC有3个来源:骨髓、外周血和新生儿脐血。DC 可由人骨髓、脐血和成年人外周血中的CD34+细胞和人外周血中的CD14+单核细胞产生。在临床应用方面,与脐血、骨髓来源相比,外周血CD14+单核细胞来源DC的培养方法具有取材容易、培养方便、供者适用性好、成熟阶段易于调控的优点，特别是对于肿瘤免疫的研究，外周血来源DC是目前公认获得成熟DC的较佳途径。DC的培养分为启动培养和分化培养两个阶段:GM-CSF、IL-4 应用7天诱导出非成熟DC；应用成熟诱导因子促使DC成熟。目前证明的促成熟因子有: ①细菌菌体或其产物,如LPS；②某些病毒或其核酸；③某些有炎症介质作用的细胞因子,如TNF-α；④氧自由基供体过氧化氢；⑤单核细胞条件培养液；⑥某些刺激信号,如A23187作为一种钙离子载体(calcium ionophore ,CI)，能与钙离子形成稳定的复合物，充当流动的Ca2+ 载体，使胞外Ca2+ 透过细胞膜，生理性或人为地提高胞浆游离Ca2+水平，导致Ca2+结合其调节蛋白-钙调蛋白，模拟某些细胞内信号转导事件，导致多基因活化［3，4］。不成熟DC 和单核细胞经CI 处理均成为高度活化、成熟的DC，可以迅速表达成熟DC 的标志CD83，而且两者的T细胞致敏效应相当［5］。
Czerniecki等［5，6］证实，CD83分子的表达多出现于CI处理后4小时，于20小时达高峰，48小时开始下降，96小时已检测不到，CI处理后不再表达CD14。体外培养DC的培养基可以用加有胎牛血清、混合人(AB 型) 血清或自身血清的完全培养液(CM)［7］，也可以使用无血清培养液(SFM)培养［8-12］。血清可以提供细胞生长所需的基本营养物质，提供贴壁和扩展因子、激素、各种生长因子、结合蛋白，对培养中的细胞提供某些保护作用。但是，使用血清也有一些明显的缺点：血清中含有一些物质对细胞会产生毒性作用，如多胺氧化酶，它能与来自高度繁殖细菌的多胺起反应（如精胺、亚精胺）形成有细胞毒作用的聚精胺；此外，补体、抗体、细菌毒素等都会影响细胞的生长，甚至造成细胞死亡；胎牛血清及人异体血清有外来抗原和危险感染（如乙肝、艾滋病等）侵入的弊端，易引起过敏反应，而且有MHC限制等；自体血清中含有抑制细胞生成的因子［13］，另外自体血清中可能存在的血管内皮衍化生长因子(VEGF) 和IL-10 (白血病细胞所分泌) 又是DC分化、成熟的抑制剂［14］，从而导致用自体血清培养DC产率低。血清的这些缺点均不利于DC瘤苗的临床应用。因此，无血清培养基诱导的DC有着广阔的临床应用前景。本实验采用的X-VIVO 20TM无血清培养液具有成分明确、质量稳定、安全可靠的优点，在实验中应用无血清培养液X-VIVO 20培养可以克服使用血清的缺点，具有很大的优越性。本实验用无血清培养液X-VIVO 20培养出的DC与含血清的培养液培养出的DC，在细胞形态、细胞表面标志、DC刺激同种异体外周血T细胞的增殖能力、DC刺激的T 细胞对K562细胞的杀伤作用方面都没有显著性差异，故无血清培养液培养DC是完全可行的，而且能够避免许多弊端，具有广阔的临床应用前景。本实验中，在X-VIVO 20中加入20 g/L人血白蛋白，结果无明显提高，今后可再添加其它细胞因子，进一步优化无血清培养液条件。DC在净化微小残留病变、防止复发、延长患者无病生存期方面都具有良好的临床应用前景。将无血清培养液诱导的DC尽快应用于临床、进一步优化无血清培养液的组成将是今后面临的新课题。
【】
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