应用变性高效液相色谱技术检测肥大细胞病c-kit基因突变
作者：张凌岩, 徐功立, Nicholas C.P. Cross1
【摘要】 本研究检测7例肥大细胞病患者c-kit基因激酶编码区突变情况，以探讨该基因变异在肥大细胞病诊断及中的意义。应用PCR测定、变性高效液相色谱技术及DNA测序方法对患者进行c-kit基因外显子17~外显子19突变检测。结果表明： 1例患者外显子17 扩增产物在DHPLC中出现异常色谱峰，测序结果显示在外显子17出现A→T突变，即D816V；另2例患者外显子18/19经DHPLC检测，结果显示1个额外的色谱峰，测序结果证实在外显子18出现G→C改变，为同义突变L862L。 结论：变性高效液相色谱技术是一种高效、可靠的突变检测方法，c-kit基因突变检测对肥大细胞病临床治疗有指导意义。
【关键词】 变性高效液相色谱； c-kit基因突变； D816V； L862L； 肥大细胞病
Application of Denaturing High Performance Liquid Chromatography to Mutation Detection of the c-kit Gene in Mastocytosis
AbstractThe aim of study was to detect mutation of tyrosine domain of c-kit gene in mastocytosis using denaturing high performance liquid chromatography technique, and to investigate the significance of this gene mutation in diagnosis and therapy of mastocytosis. Genomic DNA was obtained from bone marrow or peripheral blood leukocytes using the phenol/chloroform method from 7 mastocytosis patients. PCR was performed with AmpliTaq Gold DNA polymerase and 100 ng genomic DNA to amplify the entire coding sequence and exon-intron boundaries of c-kit exon 17 ~exon 19. Denaturing high-performance liquid chromatography (DHPLC) analysis was performed on a WAVE DNA Fragment Analysis System. Each PCR product was mixed with an equal quantity of amplified human placental DNA (served as normal control) and was denatured at 95℃ for 5 minutes, followed by slowly cooling down to room temperature by 1.5℃ per minute to allow heteroduplexes formation. All the conditions for the DHPLC analysis, including melting temperature and buffer gradients were determined using the Transgenomic software Navigator. Samples with extra peaks or with different peak form on DHPLC were directly sequenced using the BigDye Terminator Cycle Sequencing Reaction kit and ABI 3100 Genetics Analyser. The results showed that DHPLC revealed an aberrant peak in one patient in exon 17 and the D816V mutation was identified by direct sequencing. The other two patients had an extra peak for exon 18/19 and direct sequencing revealed a conservative sequence change (L862L) within exon 18. It is concluded that denaturing high performance liquid chromatography is a high efficiency and reliable technique for mutation detection of c-kit gene and the detection results would be helpful for the selection of therapy in mastocytosis.
Key wordsdenaturing high performance liquid chromatography; c-kit gene mutation; D816V; L862L; mastocytosis
肥大细胞病是指体内肥大细胞异常增生的一种疾病，包括皮肤型肥大细胞病、系统性肥大细胞病、肥大细胞肉瘤及肥大细胞白血病等数种类型。系统性肥大细胞病（systemic mast cell disease, SMCD)以全身多器官组织中肥大细胞浸润及增生为特征，少数患者可在慢性SMCD的基础上发生肥大细胞白血病。原癌基因c-kit的编码产物c-kit蛋白是干细胞/肥大细胞生长因子的受体（stem/mast cell growth factor receptor)，在肥大细胞的生长发育中有重要作用。
c-kit D816V突变， 即发生在外显子17的腺嘌
呤→胸腺嘧啶点突变，导致肽链816位点的天冬氨酸（D）被缬氨酸（V）代替，是成人散发性肥大细胞病的特征和主要病因，发生于大约60%的患者 ［1］。以往对该病无特效治疗方法，近年来部分肥大细胞病患者经信号转导抑制剂伊马替尼治疗后获得了良好效果，但有D816V突变的患者则对伊马替尼耐药［2］。故检测肥大细胞病的c-kit基因突变对于选择治疗方案、判断预后有重要意义。我们用变性高效液相色谱技术(denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC)对7例系统性肥大细胞病患者的c-kit基因外显子17-19全长进行突变扫描，以确定D816V的发生率，预测患者对伊马替尼的疗效，并在这3个编码激酶区的外显子中检测是否有其他的突变。
材料和方法
病例
7例系统性肥大细胞病患者系英国Hammersmith 及Bartholomew医院患者。男4例，女3例，中位年龄48岁（29-74岁）。
DNA提取
标本取自患者骨髓2 ml或外周血5 ml，常规酚/氯仿法提取基因组DNA，于-20℃保存备用。
突变检测
应用DHPLC技术进行突变检测。DHPLC技术是近年来用于筛选DNA结构变异的一项新技术，其原理是：在DNA部分变性情况下，当流动相缓冲液B中的乙腈梯度增加时，有错配的异源双链会早于同源双链从WAVE系统的固定相中被洗脱出来而被紫外检测系统检测到异常的色谱峰。但如果突变是纯合子或半合子，则无法形成异源双链。所以我们将所有待测样本分别与野生型的正常人胎盘DNA（Sigma公司产品）等量混合后变性及缓慢复性，若待测DNA中有突变存在，将在复性时形成自身同源双链的同时与正常DNA形成异源杂合双链，进而显示出异常的色谱峰。
引物设计与合成各引物序列均选在内含子部位且距剪接点40-60 bp以保证扩增全长待测外显子及剪接区域，因内含子18较短，故外显子18、内含子18及外显子19使用1对引物同时扩增。引物由美国Sigma公司合成。
引物序列如下： 外显子17： 上游 5'-GTGAACATCATTCAAGGCGT-3'； 下游 5'- GTGTGATATCCC-TAGACAGG-3'。 外显子18/19：上游 5'-GCAACAGCAGCATCTATAAG-3' ； 下游 5'- ACCCTCAACATCTGGGTTTC- 3'。
基因组DNA扩增反应体系为75 μl，组成为：上游及下游引物(100 pmol/μl) 各0.375 μl， dNTP (20 mmol/L) 0.75 μl，10×缓冲液7.5 μl，Ampli Taq Gold DNA聚合酶(5 U/μl) 0.375 μl，DNA 100 ng, MgCl2(25 mmol/L) 4.5 μl。PCR条件为： 95℃预变性5分钟； 94℃变性1分钟，外显子17 58℃退火1分钟、外显子18/19 62℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，扩增33个循环；最后72℃ 延伸10分钟。扩增产物长度外显子17为412 bp，外显子18/19为495 bp。取扩增产物5 μl 1.5%琼脂糖凝胶100 V电泳30分钟，溴化乙锭染色，紫外分析成像系统观察电泳结果并打印。
DHPLC检测将上述扩增后的患者DNA 20 μl分别与人胎盘正常对照DNA 20 μl混合，95℃变性5分钟，然后缓慢复性（每分钟降低1.5℃至室温）。之后将各待测样本置于WAVE色谱仪（Transgeno-mic公司产品，美国）的96孔板上，输入DNA序列；根据软件Navigator（Transgenomic）的提示选择最佳运行温度：外显子17为56℃及57℃，外显子18/19为58℃及60℃，在该运行温度下DNA片段的1%-50%将解旋形成单链 DNA（即DNA部分变性）。流动相的组成为缓冲液A： 100 mmol/L TEAA(三乙铵乙酸酯，triethylammonium acetate)，pH 7.0，0.1 mmol/L EDTA (色谱纯)；缓冲液B：100 mmol/L TEAA及25%乙腈(acetonitrile)，pH 7.0，均为美国Transgenomic公司产品。最佳缓冲液梯度亦由软件Navigator设定：外显子17缓冲液B起始含量为57.3%，外显子18/19 缓冲液B起始含量为58.5%；每分钟缓冲液B含量提高2%以形成缓冲液梯度，梯度形成时间为4分钟。设定每份标本进样量为8 μl，以流速为0.9 ml/min运行样本，分离柱保留时间为6.3分钟。另取人胎盘DNA 40 μl做为阴性对照。紫外线检测波长为260 nm，运行结果在色谱仪上显示并打印。对显示异常色谱峰的样本将进行DNA序列测定。
测序
应用BigDye Terminator Sequencing Kit Version 3.1（ABI，Foster City，CA，USA）进行双向DNA测序反应；反应产物应用DyeEx 2.0 Spin Kit纯化。 将纯化的DNA溶于10 μl去离子甲酰胺中，然后置入ABI 3100 DNA测序仪中进行测序。数据分析软件为Data Collecting Software Version1.1 及Sequence Navigator Version1.0.1。
结果
1例患者外显子17扩增产物DHPLC分析结果与对照标本比较显示一个异常的色谱峰，测序结果与GenBank上的序列() 进行比较后显示其在外显子17出现A→T（腺嘌呤→胸腺嘧啶）错义突变， 相应的密码子由GAC变为GTC，多肽链816位点的氨基酸由天冬氨酸改变为缬氨酸，即D816V（图1A、B）；另2例患者外显子18/19扩增产物DHPLC结果显示1个额外的色谱峰，测序结果证实在外显子18出现G→C（鸟嘌呤→胞嘧啶）改变，密码子由CTG变为CTC，但并没有改变862位点的编码氨基酸亮氨酸（L862L），所以是一个同义突变（图2A、B）。
讨论
c-kit基因位于染色体4ｑ12，全长约102.42 kb， 共包含21个外显子；其mRNA全长4 813 bp，编码由976个氨基酸组成的145 kD的蛋白质c-kit（CD117）。c-kit是一种受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase, RTK)，属于第Ⅲ型RTK成员之一，在信号转导系统中具有重要作用，与细胞增殖分化密切相关。c-kit的mRNA可在造血干/祖细胞、肥大细胞、生殖细胞、黑色素细胞及胃肠道起搏细胞中表达，激酶的活性对这些细胞的生长是必不可少的［3］。c-kit与其配体干细胞因子结合后发生二聚体化及自身磷酸化，进而激活激酶及下游信号分子，通过多种信号转导通路调节核内基因的活动。c-kit基因的突变将导致c-kit受体持续激活，进而使信号转导通路持续激活，细胞处于持续增殖状态，是肥大细胞病发生的分子生物学基础。已知的发生于肥大细胞病的c-kit激酶区的突变位于外显子17，主要为D816V改变，尚有D816Y（天冬氨酸→酪氨酸）、D816F（天冬氨酸→苯丙氨酸）、D816H（天冬氨酸→组氨酸）及D820G（天冬氨酸→甘氨酸）突变［4］。D816V突变可导致c-kit酪氨酸激酶活性增加10倍、激酶与ATP的结合能力增加9倍。少数患者有c-kit 编码细胞内近膜区序列的突变［4］。信号转导抑制剂(signal transduction inhibitor)伊马替尼（格列卫，Gleevec, STI571）对慢性粒细胞白血病的取得了令人鼓舞的良好效果，开创了分子靶向治疗肿瘤的新纪元［5］。伊马替尼是由瑞士诺华公司开发的一种酪氨酸激酶抑制剂，不仅高效抑制所有的ABL激酶，还以相似的特异性及活性抑制c-kit及PDGFR。c-kit激活的肥大细胞病、胃肠道基质瘤（gastrointestinal stromal tumour）等用该药治疗后均取得了良好效果［6，7］。但肥大细胞病D816V突变者则对伊马替尼耐药，而野生型及c-kit细胞内近膜区突变者对伊马替尼敏感。D816V突变者对伊马替尼耐药的机制可能由于突变型c-kit对ATP的过高的亲和力或由于D816V改变了c-kit激酶激活环的空间构象，致使突变型c-kit无法与伊马替尼结合，因而伊马替尼无法发挥作用。DHPLC技术是一种高通量、自动化筛查DNA突变的技术，目前正以其高效、高特异性、敏感性及相对价廉的优点得到了日益广泛的应用［8-10］。在我们的研究中，DHPLC色谱图有改变的样本经测序均显示DNA有变异；在我们的前期工作中曾用该方法检测了大量样本，特异性及敏感性均接近100%，提示该方法是一种高效、可靠的突变检测方法。该方法的不足之处是无法得出具体的突变位点及突变类型，还需DNA测序方法证实。本组患者突变检测结果显示，1例患者为D816V阳性，预计对伊马替尼耐药，故未用该药予以治疗；在其它6例中的5例患者用伊马替尼治疗后病情均取得了不同程度的缓解，另1例患者因症状较轻尚未用伊马替尼治疗。2例患者发现有外显子18一个已知的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP），有一些SNP特别是引起氨基酸改变者可以引起基因编码产物功能的改变［11］，与人类某些疾病的发生有密切的关系，这一SNP在肥大细胞病的确切作用还需要进一步的研究。
致谢：感谢英国Wessex Regional Genetics Laboratory的Joanna Baxter博士在本研究中给予的帮助。
【】
1 Longley BJ, Reguera MJ, Ma Y. Classes of c-KIT activating mutations: proposed mechanisms of action and implications for disease classification and therapy. Leuk Res， 2001; 25:571-576
2 Ma Y, Zeng S, Metcalfe DD, et al. The c-KIT mutation causing human mastocytosis is resistant to STI571 and other KIT kinase inhibitors; kinases with enzymatic site mutations show different inhibitor sensitivity profiles than wild-type kinases and those with regulatory-type mutations. Blood， 2002; 99:1741-1744
3 Ashman LK. The biology of stem cell factor and its receptor C-kit. Int J Biochem Cell Biol， 1999; 31:1037-1051
4 Feger F, Ribadeau-Dumas A, Leriche L, et al. Kit and c-kit mutations in mastocytosis: a short overview with special reference to novel molecular and diagnostic concepts. Int Arch Allergy Immunol, 2002; 127:110-114
5 Chrobak L, Voglova J. Imatinib mesylate (STI 571)--a new oral target therapy for chronic myelogenous leukemia (CML). Acta Medica(Hradec Kralove), 2003; 46:85-89
6 Pardanani A, Elliott M, Reeder T, et al. Imatinib for systemic mast-cell disease. Lancet, 2003; 62(9383):535-536
7 Croom KF, Perry CM. Imatinib mesylate: in the treatment of gastrointestinal stromal tumours. Drugs, 2003; 63:513-522
8 Le-Gac G, Mura C, Ferec C. Complete scanning of the hereditary hemochromatosis gene (HFE) by use of denaturing HPLC. Clin Chem, 2001; 47:1633-1640
9 Xiao W, Oefner PJ. Denaturing high-performance liquid chromatography: a review. Hum Mutat, 2001; 17:439-474
10 Ravnik-Glavac M, Atkinson A, Glavac D, et al. DHPLC screening of cystic fibrosis gene mutations. Hum Mutat, 2002; 19:374-383
11 Thunberg U, Tobin G, Johnson A, et al. Polymorphism in the P2X7 receptor gene and survival in chronic lymphocytic leukaemia. Lancet, 2002; 360(9349):1935-1939.
