兔骨髓间充质干细胞的生物学特征及其对不同生长因子的反应
作者：李栋，沈柏均， 侯怀水，时庆， 张乐玲1，马秀峰
【摘要】 为了研究兔骨髓间充质干细胞(rBM-MSC)的生物学特征及其对不同生长因子的反应，使用贴壁培养法从兔骨髓单个核细胞中获得间充质干细胞（MSC），在光学显微镜和显微镜下观察其基本生长行为和生物学特征；使用流式细胞仪检测rBM-MSC的免疫学表型；RT-PCR法检测其胶原表达；诱导rBM-MSC多向分化并使用特异性染色和RT-PCR予以鉴定；最后使用MTT法检测IL-1、3、8和HGF对rBM-MSC生长增殖的影响。结果显示：贴壁生长的rBM-MSC具有典型的成纤维样细胞形态，可传15代以上，第5代rBM-MSC高表达基质受体CD44（32％），低表达造血细胞标记CD45（4.7％）；RT-PCR显示高表达I型胶原，弱表达II型胶原，不表达X型胶原；在不同的诱导条件下，rBM-MSC 可被诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和神经元样细胞。rBM-MSC对IL-3最为敏感，10 ng/ml的低浓度IL-3可显著促进细胞增殖达32％以上（P<0.01），而高浓度IL-3能显著抑制其生长。结论：分离培养了rBM-MSC，其生物学特征与人和猕猴等BM-MSC相似的生物学特性，低浓度IL-3可有效促进其增殖。
【关键词】 骨髓； 间充质干细胞；生长因子；兔
Biological Characteristics of Rabbit Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells and Their Response to Different Growth Factors
AbstractThis study was aimed to analyze the biological characteristics of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells (rBM-MSCs) and their response to different growth factors. Rabbit BM-MSCs were separated from bone marrow mononuclear cells by using adherent cultivation. Biological characteristics were investigated by optical and electron microscopy. Immunophenotype of rBM-MSCs was measured by flow cytometry. The expression of collagen was detected by RT-PCR. Differentiation potential was identified by specific staining and RT-PCR. The response of rBM-MSCs to IL-1, 3, 8 and HGF with different concentrations were tested by MTT. The results showed that the rBM-MSCs gave rise to a population of adherent cells characterized by the presence of a predominant cell type with a typical fibroblast-like morphology and could be cultured for over 15 passages. CD44 was highly expressed on F5 rBM-MSCs (32%) and CD45 was lowly expressed (4.7%). Type I collagen was highly expressed, while type II collagen was lowly expressed and type X collagen was not detected on rBM-MSCs using RT-PCR method. In various conditions inducting differentiation, rBM-MSCs could differentiate into the osteoblast, chondrocyte, adipocyte and neuron-like cells. The rBM-MSCs were sensitive to IL-3, even low concentration (10 ng/ml) of IL-3 could promote the proliferation of rBM-MSCs effectively (>32％, P<0.01), whereas high concentration IL-3 inhibited it significantly. It is concluded that rabbit BM-MSCs were successfully isolated and culture-expanded. The biological characteristics of rabbit BM-MSCs are similar to those of human and rhesus BM-MSCs. IL-3 with low concentration can promote the proliferation of rBM-MSCs effectively, but high concentration of IL-3 can inhibit their proliferation.
Key wordsbone marrow; mesenchymal stem cell; growth factor; rabbit
骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell, BM-MSC）具有高度自我更新和多向分化的潜能，在不同的诱导条件下，可分化为多种组织细胞类型，如骨髓基质细胞、成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞［1］。目前对人和小鼠等物种的BM-MSC
已有深入研究，但对兔BM-MSC的生物学特性，尤其是其免疫学表型和对不同生长因子的反应鲜有报道。兔的形体较大，便于进行移植和观察，对兔BM-MSC的生物学特性进行深入的研究对实验生物学具有重要意义。本研究采用贴壁培养法，在体外培养、扩增兔BM-MSC，对其形态特征、表面标记、多向分化功能以及对不同细胞因子的反应进行初步研究，为以后的移植模型研究奠定基础。
材料和方法
实验动物
3月龄雄性新西兰大白兔6只，体重1.8± 0.2公斤/只，购自山东省农科院兔场。
兔BM-MSC的分离培养
对兔按3％戊巴比妥钠1 ml/kg体重行耳缘静脉麻醉，无菌取股骨骨髓1 ml（肝素终浓度50 U/ml）。用淋巴细胞分离液（上海华精生物公司产品，相对密度1.077）获得单个核细胞，以4×105/ml的密度悬浮于含10％小牛血清（杭州四季青产品）的高糖DMEM（Gibco/BRL公司产品）中，置100％湿度、5% CO2、37℃条件下培养72小时后全量换液，弃非贴壁细胞，每3天全量换液，约2周后贴壁细胞铺满80％瓶底， 用0.25％胰蛋白酶（Gibco/BRL公司产品）常规消化传代。
电子显微镜观察和细胞组织化学染色
取第5代BM-MSC进行扫描电子显微镜和透射电镜观察，并进行常规碱性磷酸酶染色（ALP）和糖原染色（PAS）。
免疫表型检测
取第5代处于对数生长期的BM-MSC，消化后用含0.1％ BSA的PBS悬浮，调整密度为1×106/ml，分别标记鼠抗兔CD44、鼠抗兔CD45和鼠抗MHC-I型分子抗体（IgG1，Serotec公司产品）10 μl，室温放置30分钟；另取1管作IgG同型对照；以缓冲液洗去未结合抗体，再加入200 μl FITC－羊抗鼠二抗（IgG，Beckman Coulter公司产品），避光孵育20分钟，缓冲液洗去未结合抗体，流式细胞仪（CYTOMICSTMFC 500型，Beckman Coulter公司产品）检测，结果用CYTOMETER 1.0软件分析。
诱导分化及鉴定
成骨细胞取第5代处于对数生长期的BM-MSC，约60％融合时加入成骨细胞诱导培养液（含10％小牛血清，地塞米松0.1 μmol/L，维生素C 0.2 mmol/L，β-甘油磷酸钠50 mmol/L，Sigma公司产品），每3天全量换液1次，2周后行碱性磷酸酶染色和茜素红S染色。
软骨细胞取培养第5代处于对数生长期的BM-MSC，约60％融合时加入软骨细胞诱导培养液（含10％小牛血清，TGF-β1 3 ng/ml（PeproTech EC公司产品），地塞米松 0.1 μmol/L，β-甘油磷酸钠 5 mmol/L，维生素C 0.2 mmol/L，胰岛素 2 μg/ml，丙酮酸钠 30 μg/ml，牛血清白蛋白 0.4 mg/ml，亚硒酸 2 μg/ml，亚油酸 2 μg/ml，Sigma公司产品），诱导2周后甲苯胺蓝染色检测胶原表达，RT-PCR检测软骨特异性Ⅱ型、Ⅹ型胶原和aggrecan基因表达。
脂肪细胞取第5代处于对数生长期的BM-MSC，约90％融合时加入脂肪细胞诱导培养液（含10％小牛血清，胰岛素6.25 μg/ml，地塞米松 0.1 μmol/L，IBMX 0.25 mmol/L，吲哚美辛 100 μmol/L（均为Sigma公司产品），2周后油红O染色鉴定。
神经细胞取第5代处于对数生长期的BM-MSC，约90％融合时加入预诱导培养液（含10％小牛血清，bFGF 10 μg/L（PeproTech EC公司产品），48小时后加入神经细胞诱导培养液（含10％小牛血清，1％ DMSO，BHA 50 μmol/L，Sigma公司产品），3天后RT-PCR检测神经细胞特异性nestin和NF-M基因表达，免疫组织化学鉴定神经特异性抗原NSE的表达，一抗为鼠抗兔NSE，二抗为生物素化羊抗鼠IgG（武汉博士德生物公司产品）。
基因表达的RT-PCR检测
细胞总RNA提取使用TRIzoL试剂 (Invitrogen公司产品),反转录按照RT-PCR试剂盒（购于北京博大泰克生物公司）说明书操作。所得cDNA用于PCR扩增，引物见附表（上海博亚生物公司合成）:扩增程序为95℃ 30秒，65℃ 45秒，72℃ 45秒，5个循环；95℃ 30秒，60℃ 45秒，72℃ 45秒，20个循环；95℃ 30秒，55℃ 45秒，72℃ 45秒，4个循环；最后72℃ 延伸10 分钟，PCR产物使用 2% 琼脂糖凝胶电泳分析。
不同细胞因子对兔BM-MSC增殖的影响
取第5代处于对数生长期的BM-MSC，以2 000个细胞/孔的密度培养于96孔板中，培养基为含10％小牛血清的高糖DMEM，分别加入不同浓度的IL-1、3、8和HGF（PeproTech EC公司产品），每组设12个复孔，培养48小时后常规MTT法检测MSC对不同生长因子的增殖反应，酶联检测仪(INTEC公司产品，Reader 2010型)检测492 nm处吸光值。Table. Primer sequence（略）
统计学处理
计量数据用X+SD表示，组间差异分析用 t 检验, P<0.01认为差异有显著统计学意义。
结果
细胞形态及特异性染色
兔骨髓单个核细胞在贴壁培养72小时后可见少量细胞贴壁，10天后BM-MSC能铺满80％瓶底，以成纤维样细胞为主，HE染色可见核内有2-4个明显核仁（图1A）；扫描电子显微镜下可见大部分细胞表面光滑（图1B），少数梭形细胞有丰富的表面片状皱褶；透射电子显微镜观察显示，膜光滑有少量微绒毛的成纤维样细胞占大多数，该细胞核与细胞质比约为1∶5，细胞核中常染色质丰富、分布均匀，图1C可见双核仁，核仁大而结构清晰，核膜完整，可见内质网、高尔基复合体、线粒体、溶酶体和一些髓鞘样小体，胞质中分别有大量核糖体和微丝。BM-MSC细胞膜微绒毛较多，靠近这些突起的细胞质中分布有致密的微丝，形成一条高电子密度带（图1D）。细胞化学染色2%-3％的细胞碱性磷酸酶阳性，在胞质内有红棕色沉淀，阳性细胞在形态上与阴性细胞没有差异（图1E）；糖原染色全部细胞均为阳性，胞质含大量紫红色糖原颗粒（图1F）。
诱导分化结果及其鉴定
加入成骨细胞诱导培养液2-3天后，细胞开始从长梭形缩短为多角形，细胞体积增大，诱导14天后茜素红S染色为阳性，碱性磷酸酶阳性细胞大幅增加，表现出成骨细胞的特点（图2A-C）；加入软骨细胞诱导培养液后，细胞由长梭形显著缩短为椭圆形，体积增大，甲苯胺蓝染色呈阳性（图2 D、E）。RT-PCR结果表明其表达软骨细胞特异性的aggrecan基因，Ⅱ型胶原的基因表达也较诱导前增多，表现为软骨细胞分化的特点；但Ⅹ型胶原不表达（图2 I: 1-4）；成脂肪细胞诱导后细胞胞浆内开始出现细小脂滴，细胞排列无序，显微镜下可观察到高折光性的脂滴。油红O染色显示脂肪细胞内大量的大颗粒状脂滴（图2F）；神经预诱导剂加入后细胞形态变得细长，加入二次诱导剂后6小时内约有60％的细胞死亡脱壁，剩余的细胞有50％表现为神经元样细胞特有的形态，伸出细长的伪足（图2G，H）。这些细胞表现为NSE免疫组化染色阳性；RT-PCR结果显示其表达神经细胞特异性基因Nestin和NF-M（图2 I: 5-6泳道）。
细胞表型及RT-PCR检测
兔BM-MSC细胞上CD44抗原表达阳性率为32％；CD45表达阳性率为4.7％，MHC-Ⅰ型分子表达阳性率为1.8％；流式细胞仪测定结果见图3A-D。RT-PCR显示第5代的兔BM-MSC高表达Ⅰ型胶原，弱表达Ⅱ型胶原，不表达X型胶原、aggrecan、nestin和NF-M基因（图3E）。
不同细胞因子对兔BM-MSC增殖的影响
酶联检测和MTT结果显示，兔BM-MSC对IL-1、3、8和HGF的反应模式基本相同，均为低浓度促进兔BM-MSC的增殖，高浓度反而抑制细胞生长，抑制效应随细胞因子浓度增加而增加；兔BM-MSC对IL-3的反应最为明显，10 ng/ml的IL-3可显著促进细胞增殖达32％以上（P<0.01），而高浓度的IL-3对兔BM-MSC的抑制效果也较其它因子明显（图4）。
讨论
目前分离MSC的方法多基于其黏附贴壁和体外快速增殖能力，鉴定MSC则主要是根据其形态和功能。目前普遍认为BM-MSC表达CD13、CD29、CD44、CD59、CD105、CD166和HLA-ABC，不表达CD11、CD14、CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117和HLA-DR［2］。由于兔基因组计划尚未完成，兔分化抗原的抗体难以得到，本实验仅能选择CD44和CD45。细胞黏附分子CD44属于基质受体（matrix receptor），是分布极为广泛的细胞表面单链穿膜糖蛋白，在淋巴细胞、成纤维细胞和上皮细胞表面均能检测到它的表达，专一性结合透明质酸盐并介导其内吞，在细胞-细胞和细胞－基质间作用中发挥重要作用［3］。我们的实验结果显示，约1/3的兔BM-MSC表达CD44，与猕猴BM-MSC的数据相同［4］，但较人BM-MSC的数据（>94％）为低［5］，这证明了物种间存在差异。我们培养得到的兔BM-MSC高表达I型胶原，弱表达Ⅱ型胶原，不表达Ⅹ型胶原和aggrecan基因。胶原是细胞外基质的主要成分之一,目前已发现 19种胶原分子,I型胶原的分泌是MSC的标志之一，可有效地促进BM-MSC的黏附、增殖和分化［6］，有关报道证明，如将人BM-MSC向软骨细胞方向诱导分化，则aggrecan基因、Ⅱ型胶原和Ⅹ型胶原的表达就会显著增加［7］，我们的试验结果显示，将兔BM-MSC向软骨细胞方向诱导分化后，表达aggrecan基因和Ⅱ型胶原，而不表达Ⅹ型胶原，这与人BM-MSC数据有差异。兔BM-MSC除向软骨细胞分化以外，我们还成功地使其诱导分化为骨细胞、脂肪细胞和神经元样细胞，证明了其具有多向分化潜能。骨髓中BM-MSC的含量仅占1/106个有核细胞，并且随着年龄的增加或体质的衰弱，BM-MSC的数量逐渐减少［8］。因此要获得足量的MSC，大量扩增纯化是十分必要的。根据我们的实验结果， 第5代之前的兔BM-MSC具有旺盛的增殖速度，倍增时间约为40小时，细胞形态狭长；从1 ml骨髓中获得的BM-MSC传代7-8次所得细胞数目可达5×108，已经能够足够满足体内移植和一般实验研究所需。随着重复传代，细胞变得宽大，生长速度下降，这和人BM-MSC中的研究结果相似，随着BM-MSC的衰老，其对生长因子的反应能力和多向分化能力也会显著下降［9］。BM-MSC除表达IL-6、IL-8、IL-11、IL-12、IL-14、IL-15、 LIF、G-CSF、GM-CSF、M-SCF、FL 和SCF等多种细胞因子外，还能对bFGF、BMP、胰岛素、TGF-β1和HGF等多种细胞因子作出增殖或分化响应，证明其表达多种因子受体［11-13］。本实验检测了不同浓度的人IL-1、3、8和HGF对兔BM-MSC生长的影响。结果显示，低浓度的人IL-1、3、8和HGF能促进兔BM-MSC的增殖，而高浓度则抑制其增殖，其中低浓度IL-3对兔BM-MSC的促增殖作用最为显著，而高浓度的IL-3的抑制效果也较其他细胞因子明显。BM-MSC本身不表达IL-1和IL-3［11，13］，IL-3主要由活化的T细胞产生， 而IL-3受体主要表达于造血细胞上并介导造血细胞的增殖、分化或激活。有表明，人脐静脉内皮细胞也表达IL-3受体，并可被TNF或IFN上调。混合IL-3 和IFN可上调脐静脉内皮细胞表达MHC II类分子并分泌IL-6和G-CSF等造血生长因子［14］。根据我们的结果，IL-3受体也表达于BM-MSC，IL-3可能通过IL-3受体促进BM-MSC的增殖并使其表达更多的造血生长因子。总之，本研究成功地分离、培养了兔BM-MSC，检测了其免疫表型和多向分化能力，与文献报道的其他物种MSC的特性类似，并检测了不同生长因子对其生长增殖的影响，为下一步应用兔作为移植模型的研究奠定了基础。
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