线栓法大脑中动脉闭塞所致局灶性脑缺血再灌注鼠模型的脑水肿和脑梗死比的变化
作者：赵涓涓 柯国平 汤俊 黄娟 黎莉
【关键词】 大脑中动脉闭塞；局灶性脑缺血/再灌注；脑水肿；
摘要：目的：探讨短暂性右侧大脑中动脉闭塞所致局灶性脑缺血再灌注模型的脑梗死比和脑水肿的变化。方法：线栓法制作大鼠脑缺血/再灌注不同时间点模型，行TTC染色测量脑梗死比及干湿称重法测量脑含水量。 结果：脑缺血再灌注6h时大鼠脑组织即有含水量的增加，并随着时间的推移呈上升趋势，且未损伤侧中段脑组织含水量升高最为显著。TTC染色在缺血再灌注6h即可见白色梗死灶，梗死比在再灌注72h内逐渐增加。 结论：局灶性脑缺血再灌注72h内脑梗死比和脑水肿均呈进行性加重。
关键词：大脑中动脉闭塞；局灶性脑缺血/再灌注；脑水肿；
脑梗死比缺血性脑损伤（ischemia brain injury）是危及患者生命的疾病之一。而脑缺血及再灌注引起的脑水肿（hydrocephalus）是影响病人急性期与亚急性期生存的重要因素。较大面积的缺血因脑水肿致病变脑组织体积急剧增大，可诱发脑疝。缺血后的脑水肿被认为是加重脑缺血原有病变，导致脑疝及危及患者生命的主要原因［1~3］。另外，血脑屏障（bloodbrain barrier, BBB）破坏也是缺血性中风继发出血的原因，而这也是患者死亡的原因之一。目前缺血后BBB破坏引起血管源性脑水肿（vasogenic brain edema, VBE）及其对缺血病变进展的影响尚未引起足够的重视。本实验旨在进一步明确局灶性脑缺血再灌注后脑水肿的时程变化，为临床诊治提供资料。
1材料与方法
11实验动物与材料
SD大鼠56只（由武汉大学医学院动物实验中心提供），SPF级，雄性，体重280～320g。随机分为空白组（n＝8）、假手术组（n＝8）和缺血再灌注组2h、6h、12h、24h、48h每组各8只。尼龙线为上海申丁实业有限公司生产，TTC为Amresco公司（美国）生产。其余试剂均为市售。
12栓线的制备
采用6cm长3/0单股尼龙线，用记号笔在双侧距头端18mm、20mm和22mm点分别作标记，然后浸入肝素钠（12500单位）中浸泡30min后晾干备用。
13右侧大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion, MCAO）局灶性脑缺血再灌注改良模型的建立
采用longa法，略有改良。采用10％水合氯醛（0.35ml/100g）腹腔注射麻醉，颈部正中略偏右侧长约2cm的竖直切口，沿胸锁乳突肌内侧缘分离出右侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）。用6/0丝线结扎CCA近心端和ECA起始端，在CCA远心端和ICA起始端各置6/0丝线备用，用眼科剪在CCA近心端和远心端之间距离颈总动脉分叉约5mm处剪一个小口，经CCA插入3/0尼龙线至大脑中动脉起始段，插入深度为19.5±0.5mm；术中维持体温37.0±0.5℃。术后两小时用乙醚再次麻醉老鼠后将尼龙线轻轻拔退约1cm，此时记为再灌注0h。假手术插线深度为10mm，余同实验组。空白组不作任何处理。术后单笼饲养，进食颗粒食物。剔除术中出血较多、呼吸困难、取脑时有蛛网膜下腔出血及提前死亡的大鼠。
14神经功能缺损评分
动物缺血2h待苏醒后,按ZeaLonga方法评定神经功能缺损现象。0分:无任何神经功能缺失体征；1分:未损伤侧前肢不能伸展；2分:向未损伤侧行走；3分:向未损伤侧转圈成追尾状；4分:意识障碍,无自主行走［4］。动物评分在1～3 分之间为造模成功,否则弃之不用。
15红四氮唑（TTC）染色确定梗死效果
每组取4只大鼠麻醉后迅速断头取脑，从前额极开始行冠状切片，片厚约2cm，置入2％TTC水溶液中，37℃避光孵育30min后，用眼科镊分离白色区(梗死区)和红色区(正常区) ,分别称取重量,梗死比。梗死比( %) = 白色区重量/(白色区重量+ 红色区重量)［5］。
16脑含水量的测定
剩余每组大鼠在相应时间点麻醉后断头取脑，以视交叉前2mm和乳头体为标志冠状切为前、中、后三段，每段分为健侧和患侧。万分之一分析天平称取脑湿重,置100 ℃烤箱中烘烤至恒重（即两次测量重量相同）时称取脑干重,按公式:脑组织含水量= (湿重- 干重) / 湿重,测算出脑组织的含水量［6］。
17统计学处理
组间行单因素方差分析，经SPSS统计软件处理。
2结果
21神经病学表现
缺血组所有动物在麻醉清醒后均出现不同程度的偏瘫，缺血再灌注组每只大鼠在麻醉清醒后均出现左前肢不能伸展，其中15只大鼠出现向左侧行走的症状，18只大鼠出现向左侧转圈的症状，平均评分为2.28分；而假手术组和空白组未出现任何神经功能缺损症状，平均评分为0分。缺血再灌注组与空白组和假手术组间差别均具有统计学意义（P<0.05；P<0.05）。
22TTC测量梗死比（％）
正常组织经TTC染色呈红色，而梗死组织呈白色。空白组和假手术组经TTC染色后均未见有白色梗死灶（图1、2），其梗死比为0；缺血再灌注12h即可见有白色梗死灶形成(图3)，随着再灌注的进行，白色梗死灶区域逐渐增大(图4)，梗死灶主要分布于损伤侧顶叶皮质，部分额叶皮质和基底节区。缺血再灌注组与空白组和假手术组间的梗死比的差异均具有显著性（P<0.01；P<0.01），再灌注各组间差异均具有显著性（P<0.01）。其梗死比的时程变化见图51。表1各组大鼠脑梗死比的比较
23脑含水量（％）的测定
正常大脑外观左右两侧对称，背侧表面血管呈淡红色，左右分布大体均一。损伤1d和2d，肉眼可见右侧脑组织肿胀明显，MCA供血区组织苍白。各组脑组织含水量的变化如表2所示，缺血再灌注各组损伤侧脑组织含水量明显高于未损伤侧（P<0.05），且损伤侧中段脑组织水肿最为突出。如图52我们可以看到各部位脑水肿的时程变化，在脑缺血再灌注2h后脑组织含水量开始增加，在再灌注48h时增加比较明显，并持续至再灌注72h。再灌注各组间差别均具有统计学差异（P<0.05）。表2各组大鼠各脑段不同时段含水量（％）的比较注：*：与空白组比较，P<0.01；#：与前一组比较，P<0.05；##：与前一组比较，P<0.01。
3讨论
31建模的改进
在脑血管疾病的研究中，动物模型是研究缺血性脑损伤必不可少的方法，模型成功与否关键在于脑梗塞部位与范围的恒定，重复性好，并且病理生理过程尽可能模拟人的发病过程。临床上出现较多的就是颈内动脉系的大血管栓塞造成的缺血性脑损伤，其中大脑中动脉栓塞较为多见。因此本实验采用线栓法闭塞大脑中动脉所致的局灶性脑缺血与临床脑缺血的病理过程类似，具有一定的参考价值。本实验采用longa线栓法复制大脑中动脉闭塞所致的缺血性脑损伤模型，并有了以下改进：①采用略偏右侧切口。此种切口更容易暴露颈动脉鞘，且可以避免从气管旁分离血管，从而可以避免刺激气管而造成呼吸道分泌物增加，改善了术后生存质量。②栓线的预处理。本实验所用栓线事先经肝素浸泡，一者可以软化栓线，避免因栓线过硬造成插线时刺破血管，二者可以减缓血液在栓线头端凝固而减轻拔线的困难度。③拔线时的二次麻醉。拔线时用乙醚麻醉可以避免大鼠因拔线的痛苦而挣扎从而增加死亡率，而且乙醚麻醉为吸入麻醉，起效快，苏醒快，可以避免因水合氯醛二次麻醉不易掌握剂量而造成麻醉意外，也可以减短动物的麻醉时间，增加术后生存质量。此外，本实验采用单一性别的大鼠可以避免雌激素的干扰，因为雌激素对梗死灶的大小有影响，同时在整个实验过程中剔除术中呼吸困难，出血较多，取脑时有蛛网膜下腔出血和提前死亡的大鼠，可以避免人为误差，增加模型的稳定性和可重复性。
32脑梗死比
脑代谢非常活跃，对血流和氧的需要量很高，而且几乎没有葡萄糖和氧的储备，完全依赖血流供给葡萄糖和氧气，供应相应脑组织区的某支大的动脉一旦闭塞，就会造成局部脑损伤［1］。通常急性脑梗死病灶由中心坏死区及周围的缺血半暗带（ischemic penumbra）组成。坏死区由于完全性缺血导致脑细胞死亡，为不可逆损伤；而缺血半暗带仍存在侧支循环，可获得部分血液供应，且神经元死亡方式主要为凋亡，尚存在大量可存活的神经元，因此对于该区的脑组织，如果能够及时中和由死亡的细胞释放的毒性代谢产物和恢复血供，则可能获得挽救［8，9］。在本实验中，由脑梗死比测量结果可以看出，再灌注各组脑梗死比与空白组和假手术组间均有差异，且脑梗死比在再灌注72h内呈逐渐增加的趋势，提示除了恢复血供外可能尚需要其它的处理措施。目前相关研究认为MMP29［5］、MMP3、TIMP3［15］等的表达与脑梗死比高度相关，这为缺血性脑损伤发生后早期防止脑梗死体积的增大提供了一定的价值。
33脑水肿
通常脑水肿是指脑组织含水量增加所引起的脑体积增大，它有3种类型：细胞毒性脑水肿、血管源性脑水肿和混和性脑水肿。脑缺血再灌注后的脑水肿是一种细胞毒性和血管源性脑水肿的混和型。细胞毒性脑水肿在缺血性脑卒中时即刻发生，是由于急性脑缺血死亡细胞释放的细胞毒性物质引起，继发于神经元和胶质细胞肿胀，这个阶段全脑体积下降。随着缺血再灌注的进行，由于各种分子生物学机制导致血脑屏障（bloodbrain barrier,BBB）的开放或破坏，引起血浆成分外渗至细胞外间隙，出现血管源性脑水肿（vasogenic brain edema,VBE）。血管源型水肿伴有细胞外液体聚积，发生在梗死后24～48h［12］。当出现大面积的脑水肿可导致颅内压增高，使得血管受压阻塞、管腔变窄，引起脑循环机能障碍，形成缺血、水肿和颅内高压恶性循环，甚至发生脑疝危及生命。如在脑梗死超早期给予溶栓，可以减轻脑损伤，改善脑梗死患者的预后，而溶栓也就是再灌注的过程，它可以通过氧自由基的释放、兴奋性氨基酸的作用等而引起非缺血性、缺氧性的损伤而加重原有的损伤，加重病情。
根据指出［13、14］，脑组织含水量增加的多少，反映脑水肿的程度。从本实验脑组织含水量的变化结果可以看出，正常鼠脑的含水量约为7454%，在再灌注6h时含水量即有增加(7623%)，随着再灌注的进行，含水量逐步增加，在再灌注12h时显著增加，再灌注48h～72h达到高峰，这说明在72h内脑水肿程度都是呈进行性加重，这与其他结果也是相类似的［13］。此外，水肿部位位于损伤侧，以中段为主，也就是大脑中动脉供应区域为主，而未损伤侧未出现明显水肿，因此导致一侧脑容积增大，颅内压力不均衡，如果损伤侧水肿过于严重，就会因为压力差而引发脑疝，危及患者生命。
本实验中，空白组和假手术组均未见脑梗死和脑水肿，缺血再灌注组则在再灌注72h内随着时间的推移梗死比和脑水肿逐渐加剧。当缺血持续时，缺血中心区域逐渐扩大，半暗带的可逆损伤也逐渐变为不可逆损伤，因此出现了梗死比逐渐增加的结果。急性脑缺血后死亡细胞释放的细胞毒性物质可以引起细胞毒性脑水肿，因此在缺血的同时死亡细胞的不断增加也不断加重细胞毒性脑水肿，同时由于各种分子生物学机制导致血脑屏障（bloodbrain barrier,BBB）的开放或破坏，引起血浆成分外渗至细胞外间隙，出现血管源性脑水肿（vasogenic brain edema,VBE），所以脑水肿在72h内呈加重趋势。脑梗死区血流再通后氧与葡萄糖供应及脑代谢恢复，脑组织损伤理应得到恢复。然而，实际上并非如此，这是因为存在再灌注损伤（reperfusion damage）。目前认为再灌注损伤的机制可能为：①毛细血管水平无复流或不再流现象；②细胞膜与线粒体受损引起钙超载；③缺血后白细胞粘附引起局部血流环境改变，内皮细胞肿胀、变形，毛细血管狭窄、痉挛；④氧自由基导致的细胞损伤［10，11］。脑缺血再灌注后继发的脑水肿，会降低脑的灌注压，损害毛细血管和增大氧气从血液弥散到细胞的距离，从而进一步加重原有的脑缺血改变。
缺血半暗带和再灌注损伤概念的提出更新了急性脑梗死的临床治疗观念，抢救缺血半暗带的关键是超早期溶栓治疗，减轻再灌注损伤核心是积极采取脑保护治疗。本实验仅仅模拟了大脑中动脉闭塞造成局灶性脑梗塞后的脑梗死比及脑水肿的变化，而对其影响因素的研究将在日后的实验工作中作进一步探讨。
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