地塞米松诱导体外培养星型胶质细胞凋亡机制的研究

                  作者：金红艳　欧阳铭　戴冀斌

【关键词】  地塞米松；星型胶质细胞；凋亡；P53；Bax；Bcl2

　　摘要：目的： 探讨地塞米松引起体外纯化培养的大鼠大脑皮质星型胶质细胞凋亡的机制。方法： 不同浓度的地塞米松（浓度为10-5、10-4、10-3mol/L）与纯化培养的大鼠大脑皮质星形胶质细胞共同孵育24小时后，用免疫细胞化学方法检测P53、Bax及Bcl2在星型胶质细胞内的表达情况，表达的强弱用平均光密度表示。结果： P53和Bax的表达随着地塞米松浓度的升高而增强，与对照组比较，各组均有极显著性差异（P<0.01）,Bcl2的表达随着地塞米松浓度的升高先是增强而后减弱，与其他组比较10-3组有显著性差异（P<0.05）。结论： P53和Bax的表达增强可能是大剂量地塞米松引起星型胶质细胞凋亡的主要因素。

    关键词：地塞米松；星型胶质细胞；凋亡；P53；Bax；Bcl2

　　在哺乳动物的中枢神经系统内约有一千亿个神经元，而在这些神经元的周围又约有十倍以上的胶质细胞存在，其中以星型胶质细胞数量最多。传统观点认为，星型胶质细胞只对神经元起结构和功能上的支持作用，但近年来越来越多的证据表明，星型胶质细胞在中枢神经系统内扮演着更为积极和更为重要的角色，这也是胶质细胞成为神经领域研究热点的一个直接原因。糖皮质激素(glucocorticoid, GC)是一类具有神经活性的甾体激素，已有许多实验证实GC对神经元的生长、分化和凋亡都起重要的调节作用，但对胶质细胞的影响报道不多。已有报道证实大剂量的地塞米松可诱导体外培养的星型胶质细胞凋亡［1］，为进一步探讨其机制，我们做了如下研究。

    1材料和方法

    11材料

    新生Wistar大鼠6只（由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供）；DMEM/F12培养基（GIBCO公司）；胎牛血清和小牛血清（GIBCO公司）；L谷氨酰胺（上海伯奥生物科技有限公司）；地塞米松（湖北恒生制药有限公司）；兔抗p53、Bax、Bcl2抗体（santa cruz公司）；SABC 免疫组化试剂盒及DAB试剂盒（北京中山公司）；24孔培养板（Corning公司）；HPIAS1000高清晰度彩色病理图文报告分析系统（同济千屏影像公司）；SL2300二氧化碳培养箱（美国Sheldon公司）；UFXII光学显微镜（日本Nikon公司）。

    12方法

    121星形胶质细胞的纯化培养将出生1~2天的新生Wistar大鼠用75%的酒精浸泡消毒后，采用无菌方法迅速取出大脑，用DHanks液清洗并剔除脑膜和血管，取大脑皮质，将组织剪碎为1mm3大小，用0.125%胰蛋白酶37℃消化数分钟，过滤（200目），离心（1000rpm 5min），去上清，加入DMEM/F12完全培养基（其中含5%胎牛血清，10%小牛血清，L谷氨酰胺2mmol/L，青霉素100u/ml,链霉素0.1mg/ml）制成细胞悬液。计数后按5×104/cm2接种于培养瓶，加入DMEM/F12完全培养基，在37℃、5%CO2培养箱中培养9天（每3天更换培养液一次），第9天将培养瓶置于恒温旋转摇床上(240rpm)，摇18小时，去掉含有悬浮细胞的培养液，用DHanks液清洗3次，进行传代培养即得纯化的星形胶质细胞［2］。  经免疫细胞化学方法检测，95%以上的细胞GFAP免疫反应为阳性。

    122实验分组在24孔培养板的每一孔内放入一张1cm2消毒过的玻片，涂上多聚赖氨酸，然后将星型胶质细胞分组种在玻片上（细胞爬片）。纯化的星形胶质细胞被分成1个对照组和3个实验组，每组3个样本。对照组不加地塞米松，其它3组分别加入终浓度为10-5、10-4、10-3mol/L的地塞米松。在37℃、5%CO2条件下，继续培养24小时, 然后作免疫细胞化学分析。

    123免疫细胞化学染色将各组细胞爬片进行SABC法免疫细胞化学染色。每一培养孔中的细胞爬片经固定、封闭非特异性抗原和消除内源性过氧化物酶等处理后，首先加入特异性抗体（P53、Bax、Bcl2），4℃孵育72h。然后依次加入生物素化羊抗兔IgG，37℃、1h；SABC复合物，37℃、1h；DAB显色5min。每步间均用PBS充分洗涤。所有爬片经脱水、透明、中性树胶封片后，光镜下观察、摄片。

    以正常兔血清和PBS缓冲液替代一抗作对照染色，结果为阴性。

    124图像分析用HPIAS1000高清晰图像分析系统进行阳性细胞计数及平均光密度分析。所得数据应用SPSS统计软件，以方差分析进行统计分析，P＜0.05定为差异有显著性,数据以均数±标准差（±s）表示。

    2结果

    21形态学观测结果

    P53  对照组：可见少数免疫反应阳性细胞，反应产物呈棕黄色，主要见于胞核（图1）。10-5组：免疫反应阳性细胞增多，反应产物呈棕黄色，见于胞核，胞浆淡染（图2）。10-4组：免疫反应阳性细胞明显增多，反应产物呈棕黄色，见于胞核，胞浆也有表达（图3）。10-3组：大多数细胞呈免疫反应阳性，反应产物呈棕褐色，胞核胞浆界限不清（图4）。

    Bax  对照组：细胞大小形态一致，核膜着色呈棕黄色，胞核中央有透亮区，胞浆淡染（图5）。10-5组：免疫反应产物颜色加深，细胞形态变化不大（图6）。10-4组：颜色进一步加深，细胞形态无太大变化（图7）。10-3组：免疫反应产物呈棕褐色，胞浆染色明显加深，少数细胞体积缩小，核浓缩、深染（图8）。

    Bcl2  对照组、10-5组、10-4组这3组细胞大小形态基本一致，细胞着色变化也不大，胞核胞浆均有着色，反应产物呈棕黄色（图9~11）。10-3组：与前3组比较，10-3组细胞染色明显变浅，尤其是胞浆明显淡染（图12）。图1对照组P53的表达(×200)图210-5组P53的表达(×200)

    22图像分析结果

    221地塞米松对P53表达的影响不同浓度（对照组、10-5组、10-4组、10-3组）地塞米松与纯化的星型胶质细胞共同孵育24小时后，P53的表达随着地塞米松浓度的升高而逐渐增强，与对照组比较各组均有极显著性差异（P<0.01），各浓度组（10-5组、10-4组、10-3组）之间两两比较也有极显著性差异（P<0.01），见表1。

    222地塞米松对Bax表达的影响不同浓度（对照组、10-5组、10-4组、10-3组）的地塞米松与纯化的星型胶质细胞共同孵育24小时后，Bax的表达也随着地塞米松浓度的升高而增强，但其幅度有所减缓，与对照组比较各组均有极显著性差异（P<0.01），各浓度组（10-5组、10-4组、10-3组）之间两两比较有显著性差异（P<0.05）,见表1。

    223地塞米松对Bcl2表达的影响不同浓度（对照组、10-5组、10-4组、10-3组）的地塞米松与纯化的星型胶质细胞共同孵育24小时后，Bcl2的表达变化较复杂，先是10-5组呈现增强趋势，从10-4组开始出现减弱趋势，至10-3组出现明显减弱，其中对照组、10-5组、10-4组之间经过统计学分析没有显著性差异（P>0.05）,而10-3组与其他各组比较有显著性差异（P<0.05）,见表1。 表1星型胶质细胞经Dex处理后P53、Bax、Bcl2表达的平均光密度

    224地塞米松对Bax与Bcl2表达比值（Bax/Bcl2）的影响把每一浓度组Bax表达的平均光密度与同组Bcl2的平均光密度作一比值，我们发现随着地塞米松浓度的升高，Bax/Bcl2值也逐渐升高，而10-3组最为显著，见表2。表2星型胶质细胞经Dex处理后Bax与Bcl2平均光密度比值

　　3讨论

    细胞凋亡（程序化细胞死亡）与细胞坏死完全不同，它是一种积极意义上的细胞死亡，它不但在病理条件下而且在多种生理条件下发挥着重要的作用［3,4］。有大量证据表明，在胚胎发育过程中发生的神经细胞的死亡大多与凋亡有关［5］。另外，局部缺血、兴奋毒性作用、脑外伤和慢性退行性病变等都可促使凋亡的发生［4,6］。已有报道证实，大剂量的地塞米松可引起体外纯化培养的星型胶质细胞凋亡［1］，但其确切机制尚不清楚。为了探讨其中的机制，我们设计了本实验，检验地塞米松是否引起了P53、Bax及Bcl2表达的变化。我们发现，P53的表达随着地塞米松浓度的升高而逐渐增强，Bax的表达也随着地塞米松浓度的升高而增强，但其幅度有所减缓，Bcl2的表达先是10-5组呈现增强趋势，从10-4组开始出现减弱趋势，至10-3组出现明显减弱，这样导致Bax/ Bcl2值逐渐升高，10-3组最为明显，这可能是10-3组引起星型胶质细胞凋亡的直接原因。

    众所周知，很多原因比如缺血、放射线以及兴奋毒性作用都可以引起P53表达的增强，最终导致神经细胞凋亡［2，7］。P53基因编码的产物，即P53蛋白可以调节Bax的表达，而Bax可能是介导P53依赖的神经细胞凋亡的主要因素［8］。另外，White et al发现在敲除掉Bax基因的小鼠大脑中很难找到死亡的神经细胞［9］。有人发现P53可以通过降低Bcl2的表达来间接地引起细胞凋亡［10］。Bax可以通过与Bcl2形成同型或异型二聚体来促进凋亡的发生［11］，因此，Bax与Bcl2比例的变化就可以决定某些细胞是存活或是死亡［11］。在本实验中，地塞米松引起P53持续升高，Bax也有类似的表现，而Bcl2是先升后降。总之，P53、Bax、Bcl2经过地塞米松作用后其表达都发生了显著的改变，尤其是10-3组，这提示它们在地塞米松诱导星型胶质细胞凋亡的过程中发挥着重要的作用。 Bax表达增强可能是P53表达增强的结果，因为P53可以促进Bax的转录和翻译［10］。另一方面，P53表达的增强又可能抑制了Bcl2，使它表达下降［10］，但是细胞本身可能存在一种抗凋亡的补偿机制［12］，使得在Bax表达增强的情况下Bcl2也加强表达，以对抗Bax的促凋亡作用，但这种抗凋亡作用是有一定限度的，因此，Bcl2的表达先增强后减弱。Bax/ Bcl2值因此进行性升高，这可能直接导致10-3组星型胶质细胞凋亡。

    地塞米松引起P53和Bax表达增强可能是通过作用于胞浆内的糖皮质激素受体开始的。L.E.Haynes报道地塞米松能引起在体纹状体和海马神经元凋亡，但这种作用可被糖皮质激素受体阻滞剂RU38486阻断［13］。类似的报道还有，Karine发现地塞米松能诱导脾B淋巴细胞凋亡，但同样可被RU486完全阻断［14］。地塞米松与胞浆内的糖皮质激素受体结合后，受体的构象发生改变，激素受体复合物进入核内与激素反应元件GRE结合，可能激活或抑制某些基因的转录，最终导致P53和Bax表达增强，其确切机制有待进一步研究。Bax能与自身形成二聚体，这种二聚体在线粒体膜上可以组成离子通道［15］，线粒体膜内外的小分子和离子可通过该通道进行被动扩散，结果引起线粒体膜电位的改变，去极化，细胞色素C释放入胞浆，继而引起与细胞凋亡有关的一系列蛋白酶（Caspases）的活化，最终导致细胞的凋亡。

    1王珍，刘仁刚，周洁萍，等地塞米松诱导培养的大鼠大脑皮质星型胶质细胞凋亡. 组织化学和细胞化学杂志，2002，11（3）：282~285

    2Crumrine, R.C., Thomas, A.L. and Morgan, P.F. Attenuation of p53 expression protects against focal ischemic damage in transgenic mice, J. Cereb. Blood Flow. Metab, 1994，14： 887~891

    3Kerr, J.F., Wyllie, A.H. and Currie, A.R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wideranging implications in tissue kinetics, Br. J. Cancer, 1972，26： 239~257

    4Leist, M. and Nicotera, P. Apoptosis, excitotoxicity, and neuropathology, Exp. Cell Res, 1998，239：183~201

    5Raff, M.C., Barres, B.A., Burne, J.F, et al.  Programmed cell death and the control of cell survival: lessons from the nervous system, Science, 1993，262： 695~700

    6Thompson, C.B. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease, Science, 1995,267: 1456~1462

    7Hughes, P.E., Alexi,T. Yoshida, T, et al. Excitotoxic lesion of rat bain with quinolinic acid induces expression of p53 messenger RNA and protein and P5inducible genes Bax and Gadd45 in brain areas showing DNA fragmentation, Neuroscience, 1996,74: 1143~1160

    8Xiang, H., Kinoshita, Y., Knudson, C.M., et al. Bax involvement in p53mediated neuronal cell death, J. Neurosci, 1998,18: 1363~1373

    9White, F.A., KellerPeck, C.R., Knudson, C.M.,Widespreadelimination of  naturally occurring neuronal death in Baxdeficient mice, J. Neurosci, 1998,18: 1428~1439

    10Miyashita, T., Krajewski, S., Krajewska, M., Tumor suppressor p53 is a regulator of bcl2 and bax gene expression in vitro and in vivo, Oncogene, 1994,9:1799~1805

    11Oltvai, Z.N., Milliman, C.L. and Korsmeyer, S.J. Bcl2 heterodimerizes in vivo with a coneserved homolog. Bax, that accelerates programmed cell death, Cell, 1993,74:609~619

    12S.P.Cardenas, C.Parra. Corticosterone differentially regulates bax ,bcl2 and bclx mRNA levels in the rat hippocampus  Neuroscience Letters,2002,331: 9~12

    13L.E. Haynes. Griffiths  Dexamethasone induced limited apoptosis and extensive sublethal damage to specific subregions of the striatum and hippocampus: implications for mood  disorders. Neuroscience,2001,104: 57~69

    14Karine Andreau. Induction of apoptosis by Dexamethasone in the B cell lineage Immunophamacology,  1998,40: 67~76

    15Hugh J.M. Brady, Gabriel GilGomez  Molecules in focus in Bax. The proapoptotic Bcl2  family member, Bax The international journal of biochemical & cell biology, 1998,30: 647~650