当归注射液对免疫诱导再障小鼠骨髓微环境及IL
【关键词】 再生障碍性贫血
再生障碍性贫血(aplastic anemia, AA)是血液系统常见疾病，传统的方法效果欠佳，临床死亡率高。因此，对AA发病机制的研究以及寻找有效的治疗药物具有重要的理论和实践意义。目前对于AA，国内多采用中西医结合治疗。当归是著名常用中药，具有养血活血作用［1］，过去多用于治疗腰腿痛和妇科疾病，随着临床研究的进展，其应用范围逐渐扩大。作为补血中药，其在血液系统疾病中的应用及研究也日渐增多。至目前为止，有关当归在血液系统的药理作用基本归纳为：①抑制血小板聚集及抗血栓形成；②刺激骨髓造血；③促进免疫功能恢复；④抗辐射损伤等。武汉大学人民儿科从1991年起将当归注射液用于临床治疗AA，取得较好的疗效［2］。但该药治疗AA的实验研究却少有报道。
本实验用当归注射液对免疫诱导AA小鼠进行干预治疗，观察其对AA小鼠体重、外周血白细胞计数、骨髓单个核细胞计数、骨髓微环境等的影响，并从分子水平研究其作用机制，进一步为临床应用该药治疗AA提供实验依据。
1材料与方法
11材料
111动物雌性Balb/c小鼠(H2a 、MLSb)8~12周龄，17~20 g，由武汉生物制品研究所提供。DBA/2小鼠(H2a、MLSa)8~10周龄，雌雄不拘，由上海斯莱克实验动物有限公司提供。
112药品、试剂及来源25%当归注射液由武汉大学中南医院药剂科提供，批号：0303131，每毫升含当归生药0.25g。大鼠抗小鼠CD49dRPE单克隆抗体、CD49eFITC单克隆抗体、羊抗大鼠IgGFITC荧光抗体、大鼠抗小鼠细胞周期蛋白D2单克隆抗体、溴化丙啶(PI)、Rnase A、Triton100均购自深圳晶美公司。Ficoll干粉、人淋巴细胞分离液购自美国Sigma公司。
113试剂配制
(1) 0.01mol/L磷酸生理盐水(phosphate buffer saline, PBS)的配制：
磷酸氢二钠(Na2HPO4)：3.48g；氯化钾(KCl)：0.2g；磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.2g；氯化钠(NaCl)：8.0g。加入1 L双蒸水稀释后滤纸过滤，消毒，4℃冰箱保存待用。
(2) 小鼠淋巴细胞分离液的配制：
Ficoll干粉2.1g加入20 ml双蒸水，配成10.5%溶液，过滤待用，用人淋巴细胞分离液100 ml加入配制好的10.5% Ficoll溶液7 ml，配成小鼠淋巴细胞分离液。过滤消毒，4℃冰箱避光保存待用。
(3) 台盼蓝的配制：
4%台盼蓝母液：取4g台盼蓝溶入100 ml PBS中，过滤消毒，4℃冰箱保存待用。工作浓度为0.4%。
114主要仪器(1) AIR TECH超净工作台：江苏安泰空气净化技术公司生产；(2) 网格测微器：购自上海森雄公司；(3) 博赛酶标仪。
12动物模型的制备与分组
121免疫诱导再生障碍性贫血小鼠模型的建立参照姚军等［3］方法，取DBA/2小鼠，断颈处死，常规75%酒精消毒，无菌取出胸腺及颈部、颌下、腋窝、腹股沟、肠系膜等处淋巴结，加少量生理盐水，轻轻磨碎，过滤后用1 ml注射器抽取，并将此液沿管壁缓慢加入装有配制好的小鼠淋巴细胞分离液的试管中，置水平离心机离心，转速2000转/分，20分钟后取出，可见淋巴细胞悬液在中间层，用无菌吸管将淋巴细胞悬液吸出后，用PBS冲洗二遍，离心机离心，1500转/分，5分钟，弃上清，配成单细胞悬液，台盼蓝鉴定细胞活性，活性细胞达98%。计数后配成所需浓度备用。雌性Balb/c小鼠，经60Co 6Gyγ-射线亚致死量全身照射(空气量7.39 Gy，距离80 cm，时间6.87 min)。4小时内由尾静脉输入取自DBA/2小鼠胸腺、淋巴结混合细胞，细胞量为每只1×106/0.2ml。
122分组与处理制模后小鼠分为4组，分别为模型对照组、当归注射液小剂量组、当归注射液大剂量组、丙酸睾丸酮组，每组8只，另设8只同批正常未经任何处理Balb/c小鼠为正常对照组。①正常对照组：予无菌生理盐水10 ml/kg.d腹腔注射，连续12天。② 模型对照组：于制模当天腹腔注射无菌生理盐水10 ml/kg.d，连续12天。③、④ 当归注射液小剂量组、当归注射液大剂量组：分别于制模当天给予当归注射液注射液2 ml/kg.d及10 ml/kg.d腹腔注射。⑤丙酸睾丸酮组：于制模当天腹腔注射丙酸睾丸酮10 mg/kg.d。所有小鼠均给予每升含红霉素250 mg及庆大霉素320万U的无菌水喂养。
13检测的指标及方法
131体重变化、外周血白细胞和骨髓单个核细胞计数于制模第12天小鼠称重后，经尾静脉采血，按常规方法行外周血白细胞计数后，断颈处死，取右侧股骨，用PBS冲出骨髓细胞，计数，即为1根股骨中的骨髓单个核细胞(mononucleate cells, MNC)。
132尺骨骨髓切片组织学观察取尺骨固定，塑料包埋切片，HGE染色，采用浦权等［4］的方法，于高倍镜下用网格测微器进行骨髓造血组织容量百分率的测定，测其全片骨髓造血组织所占面积(不含骨小梁)的百分比，并观察微血管和脂肪细胞。
造血组织面积(%)=各网格造血组织面积(%)之总和/测计全片骨髓的网格总数
133骨髓超微结构样本制备取尺骨中段，固定于4%戊二醛溶液中，经磷酸缓冲液充分冲洗后再固定于1%四氧化锇中，丙酮逐级脱水，环氧树脂618包埋，超薄切片，硝酸钴和醋酸钠双重染色，置于透射电镜下观察骨髓造血细胞和基质细胞变化。
134骨髓单个核细胞悬液IL3的检测制模后第12天断颈处死小鼠，制备MNC悬液，调浓度为1×107/ml，培养72小时后收集上清液，采用双抗体夹心ABCELISA法测IL3量。
14统计分析
数据以±s表示，均数比较采用t检验，P<0.05表示差别有显著性。
2实验结果
21小鼠体重、外周血白细胞及骨髓单个核细胞计数改变
实验各组小鼠体重、外周血白细胞及骨髓单个核细胞计数均明显低于正常对照组(P<0.01)，但当归注射液大剂量组及丙酸睾丸酮组较模型对照组明显增加(P<0.01)，且当归注射液大剂量组与丙酸睾丸酮组比较无显著差异，而当归注射液小剂量组与模型对照组比较无显著差异。见表1。表1当归注射液对免疫诱导再生障碍性贫血小鼠体重、外周血白细胞及骨髓单个核细胞计数的影响注：与正常对照组比较，# P<0.01；与模型对照组比较，* P<0.05，** P<0.01.
22尺骨骨髓切片组织学观察
光镜下观察骨髓造血组织容量百分率，结果表明与正常对照组比较，实验各组骨髓造血组织容量百分率均明显降低(P<0.01)，但当归注射液大剂量组及丙酸睾丸酮组较模型对照组显著增高(P<0.01)，且当归注射液大剂量组与丙酸睾丸酮组比较无显著差异，而当归注射液小剂量组与模型对照组比较无显著差异。见表2。表2当归注射液对免疫诱导再生障碍性贫血小鼠骨髓造血组织容量百分率的影响*注：与正常对照组比较，# P<0.05，## P<0.01；与模型对照组比较，* P<0.01。
23骨髓单个核细胞培养上清IL3的含量
采用ELISA法对正常对照组、模型对照组及当归注射液大剂量组骨髓MNC培养上清进行检测，结果发现，正常对照组IL3含量明显高于模型对照组，而当归注射液大剂量组的IL3含量亦明显高于模型对照组。见表3。表3当归注射液对免疫诱导再生障碍性贫血小鼠骨单个核细胞培养上清IL3的影响
3讨论
31免疫诱导再生障碍性贫血小鼠模型的建立
在建立AA小鼠模型的过程中，照射和淋巴细胞的输入是两个必需的条件，合适的照射剂量既能降低造血干细胞的数量，引起骨髓储备力下降，削弱宿主的免疫功能，抑制宿主的造血系统，诱发AA，又不至于使实验动物过早死亡。本实验AA模型经射线照射后，不仅造成造血细胞的死亡，对组成造血微环境的血窦、内皮细胞、外膜网状细胞及吞噬细胞也造成损伤，呈现血窦壁断裂，细胞器肿胀、变形等超微结构的变化。照射同时输入的具有免疫活性的淋巴细胞可使造血微环境的损伤加重，病变持续存在，影响造血细胞的正常生长代谢，最终导致造血功能不能重建，出现不可逆的AA。因此本实验模型小鼠的病理改变与人类AA相似。已知该模型AA发病时间集中在8~14天，高峰期为12天［3］，所以我们选择第12天处死小鼠，获取标本。
32AA的发病机理
AA是以全血细胞减少、骨髓造血功能衰竭为主要特征的一类贫血。目前，其发病机理主要认为与造血干细胞数目减少或功能缺失［5］，造血微环境的缺陷以及由造血微环境中基质细胞缺陷所致的正/负调节因子表达异常［6］相关。
造血微环境是造血干细胞生长、分化和自我更新的重要场所。主要由基质细胞、细胞外基质和微血管系统组成。基质细胞构成了骨髓微环境的网架结构，网架内充满造血细胞；血窦由内皮细胞构成，窦腔内有成熟红细胞和其他细胞，内皮细胞外有网状细胞，营养和发育造血细胞［7］。基质细胞在造血调控方面发挥重要的作用。它不仅作为造血细胞生长的支架，而且可通过细胞间的直接作用和分泌多种造血生长因子来调节造血细胞的增殖、分化、成熟与释放［8］。早已证实血窦的完整性及外膜网状细胞在造血的支持和诱导中也有重要作用。
33当归的药理作用
当归是中医临床最重要的补血活血药物，过去多用于腰腿痛和妇科疾病，随着临床研究的进展，其用药范围逐渐扩大。作为补血药物，其在血液系统疾病中的研究也日渐增多。
当归的水溶性部分含阿魏酸，具有增加血流量、改善骨髓微环境的功能［9］，并能稳定红细胞膜，保护红细胞免受破坏［10］。
当归多糖(angelica polysaccharide, AP)是当归中另一促进造血的有效成分。AP对贫血小鼠的红细胞、血红蛋白、白细胞和骨髓单个核细胞数恢复有显著促进作用［11］。实验表明，AP能显著增加照射小鼠脾脏内源性造血灶的形成，提高照射小鼠骨髓单个核细胞计数，增强造血功能；能防止照射后效应，显著促进照射小鼠多能造血干细胞形成单位(CFUS)和粒系定向干细胞形成单位(CFUC)的恢复［12］。对造血干细胞的增殖分化有显著刺激作用［13］。而且，体内注射AP对正常或贫血小鼠的早期红系祖细胞(BFUE)、晚期红系祖细胞(CFUE)、粒单系祖细胞(CFUGM)和巨核系祖细胞(CFUMK)的增殖均有显著促进作用［14］。
牛泱平等［15］采用体外造血祖细胞集落形成技术，首次观察了当归注射液对正常人和再生障碍性贫血患者骨髓红系、粒系的作用，结果发现，当归注射液能促进正常人和再生障碍性贫血患者骨髓造血干、祖细胞的增生和转化。
当归还具有多重调节免疫功能作用［16］。研究证实，当归对免疫器官及细胞的再生以及机体的修复具有促进作用［17］。孟庆勇等［18］发现一定剂量的体内注射当归注射液对正常及受辐射损伤小鼠脾淋巴细胞增殖具有明显的刺激作用，有利于机体免疫功能的恢复。当归注射液还能明显抑制免疫抑制剂氢化可的松对大鼠脾细胞凋亡的诱导作用［19］。
当归具有保护、促进和加速由于辐射引起的DNA合成抑制过程恢复的作用，或解除由辐射引起的物质代谢障碍［20］。刘玉兰等［21］实验证明当归注射液腹腔用药对辐射损伤的小鼠脾淋巴细胞增殖具有刺激作用，表明当归注射液腹腔用药具有抗辐射作用。
34当归注射液对AA小鼠的保护作用
341对AA小鼠造血组织容量的影响本实验模型对照组小鼠骨髓主要为脂肪细胞，造血细胞明显减少，当归注射液大剂量组能明显提高造血组织容量百分，使造血细胞明显增生。
邢金龙等的实验结果［22］也证实当归注射液具有清除氧自由基等有害物质，保护细胞器的作用。
342对骨髓微环境的影响本实验模型对照组骨髓微环境损伤突出表现为骨髓间质主要为巨大的脂肪细胞，血窦扩张、充血，血窦内皮细胞核呈梭形，无核内小体，窦壁薄而直，甚至断裂，无微绒毛，很少见到外膜网状细胞。当归注射液大剂量组造血小岛增生，血窦丰富，血窦内皮细胞核为圆形或椭圆形，常见核内小体，窦壁较厚，有丰富的微绒毛。血窦的外膜网状细胞常见。血窦的修复保证了细胞生长所需的营养物质及体液因子，无疑促进造血细胞、基质细胞的生长发育及其功能。
实验证明，当归注射液大剂量组与丙酸睾丸酮组比较，小鼠的体重，外周血白细胞、骨髓单个核细胞计数均无显著差异，骨髓微环境变化也基本一致，说明大剂量组当归注射液作用强度与丙酸睾丸酮相似。而经当归注射液小剂量组治疗的AA小鼠外周血白细胞、骨髓单个核细胞水平与模型对照组无显著差异，说明达到一定剂量的当归注射液才能对AA小鼠有保护作用。
343对BMNC培养上清中细胞因子IL3的影响 本实验分别检测了正常对照组、模型对照组及当归注射液大剂量组的骨髓MNC培养上清中IL3的含量，以期探讨当归注射液对AA小鼠的保护机理。
细胞增殖受细胞内外调控因子的影响，造血生长因子是一组调控造血干／祖细胞的增殖、分化及成熟血细胞功能的糖蛋白，它通过血液循环，到达骨髓造血组织，对其靶细胞发挥作用。根据其发挥的作用不同而分为正调控因子及负调控因子。白细胞介素3（IL3）是一种重要的正调控因子。IL3生物活性广泛，通过激活干／祖细胞表面的IL3受体，促进造血干细胞的增殖与分化。此外，IL3还增强造血干细胞对其它造血生长因子的反应，发挥协同作用。因此，在几乎所有的造血干细胞培养方案中都应用IL3，由此增生的造血干细胞被用来作基因转染，及化疗后的造血重建。IL3促进多能造血干细胞和各系祖细胞的定向分化与增殖，表现为对多种血细胞的生成有调节作用［23，24］。
35展望
当归注射液能明显促进AA小鼠骨髓造血细胞增生，改善骨髓造血微环境。其对AA小鼠的保护作用可能与其能提高骨髓造血细胞线粒体、内质网的数量，改善其质量。当归注射液是否还通过其他途径发挥作用有待进一步探讨。从理论及部分实验结果而言，当归注射液可能是治疗AA的有效药物之一。
4结论
当归注射液对免疫诱导小鼠再生障碍性贫血具有保护作用，能改善AA小鼠骨髓微环境，促进造血细胞增生。
当归注射液保护作用的机制与其能提高骨髓中造血正调控因子IL3有关。
1《全国中草药汇编》编写组. 全国中草药汇编. 上册. 人民卫生出版社, 1975，355.
2王军陵, 仲照东, 仲惟昆, 等. 川芎嗪和当归联合雄性激素和皮质激素治疗儿童再生障碍性贫血的临床观察. 中华血液学杂志, 2000,21(10): 544~545.
3姚军, 李树浓. 淋巴细胞与再生障碍性贫血关系的实验研究. 中华血液学杂志, 1991,12(5):229~231.
4浦权, 李世俊, 杨梅如，主编. 骨髓活检病. 哈尔滨:黑龙江技术出版社, 1993,59~62.
5Gibson FM, Scopes J, Daly S, et al. In vitro response of nomal and aplastic anemia bone marrow to mast cell growth factor and in combination with granulocytemacrophage colonystimulating factor and interleukin3. Exp Hematol, 1994,22:302~312.
6Macijewski JP, Liu JM, Green SW, et al. Expression of stem cell inhibitor (SCI) gene in patients with bone marrow failure. Exp Hematol, 1992,20:1112~1117.
7柴忆欢, 曹幼甫, 毛隶华, 等. 儿童再生障碍性贫血骨髓组织超微结构观察及其临床意义. 实用儿科临床杂志, 1999,14(6):332~333.
8Greenberg TS. The hematopoitic microenvironment. Crit Rev Oncol Hematol, 1991,11:65.
9吴东方, 张洪, 周本宏, 等. 阿魏酸钠抗肝脂质过氧化作用机制探讨. 中药杂志, 1996,21(5):297.
10魏蕾, 欧阳静萍, 王雄, 等. 当归对高分子右旋糖酐诱导人红细胞聚集性的影响. 微循环学杂志, 2001,11(1):30.
11王亚平, 祝彼德. 中华血液学会重庆分会成立大会会议资料汇编, 1988.
12梅其炳, 陶静仪, 张惠迪, 等. 当归多糖对照射小鼠造血干细胞的影响. 中国药理学报, 1988,9(3):279~282.
13王亚平, 祝彼得. 当归多糖对小鼠多能造血干细胞(CFUS)的影响. 解剖学杂志, 1988,11(增刊):450.
14王亚平, 祝彼得. 当归多糖对造血祖细胞增殖调控机理的研究. 中华医学杂志, 1996,76(5)363~366.
15牛泱平, 金锦梅, 高瑞兰, 等. 当归注射液对正常人和再生障碍性贫血患者造血祖细胞的刺激增生作用. 实用中西医结合杂志, 1998,11(9):772~773.
16吕世静, 何德, 黄槐莲, 等. 当归注射液免疫功能的增强效应. 中国中药杂志, 1989,14(11):45~47.
17吴琦, 王娟娟, 赵琳. 当归补血汤及其单味药对照射小鼠免疫功能的影响. 北京中医学院学报, 1993,16(4):53~55.
18孟庆勇, 徐美奕, 高莉莉, 等. 当归注射液对辐射损伤小鼠脾细胞增殖的作用. 中成药, 2003,25(2):162~164.
19吕小迅, 黄瑶, 吴新华, 等.当归注射液对氢化可的松诱导的大鼠脾细胞凋亡的影响. 中国病理生理杂志, 1999,15(8):739~740.
20张端莲, 陕声国, 张玲, 等. 当归对辐射损伤后小鼠卵巢组织影响的实验研究. 湖北医科大学学报, 1996, 17(3):216~218.
21刘玉兰, 孟庆勇. 当归注射液对辐射损伤小鼠免疫功能的作用. 广东医学院学报, 2002,20(5):334~335.
22邢金龙，赵如意.当归清除氧自由基及保护线粒体的作用.中医药研究，1996，12(4)：55~57.
23Valent P, et al. Blut .1990,61:338~345.
24Valent P, et al. J Immunol. 1990,145:3432~3437.
