干细胞治疗视网膜疾病的研究进展
【关键词】 视网膜疾病
0引言
视网膜是视觉中光电感应的部位，也是脑向外周的延伸，由于其具有直观的组织结构和清楚的神经化学递质传导通道，使视网膜信息处理的研究一直居于神经眼科学的前沿。外界光刺激、机械损伤或其他疾病的并发症均可导致光感受器的病理变化，进一步引起视网膜色素变性、视网膜脱离及其他致盲性疾病。对于这类疾病，国内外学者进行了大量的研究。随着视觉电生理、神经生物学、机科学的，对于视网膜的信息传递和调控、视网膜神经元回路、视觉行为与计算理论、视觉通路可塑性等都有较大的进展，同时也带动了视网膜疾病的治疗及其功能恢复的研究。
视网膜疾病在临床上很常见，其中既有先天性病变，如先天性视网膜色素变性，又有一些后天因外伤或其他疾病引起的并发症。如激光照射引起的视网膜损伤、糖尿病性眼病等。以激光视网膜损伤来讲，从程度上可分为轻、中及重度3级。轻度视网膜损伤表现为瓷白色凝固斑；中度损伤表现为视网膜出血。形成圆形或菊花样出血斑，但无玻璃体积血；重度激光视网膜损伤主要表现为视网膜破裂、出血、玻璃体积血，重者造成玻璃体混浊、视网膜脱离甚至失明。目前对于轻中度损伤治疗主要采取抗炎治疗或营养因子治疗。如维生素、激素以及生长因子等，治疗结果并不满意；而对重度损伤没有很好的治疗方法，主要是防止玻璃体出血、促进玻璃体内凝血的吸收，对于视网膜重度损伤、视网膜脱离则无特效药。对于其他眼病来讲。情况也是如此。因此，寻找更好的治疗方式迫在眉睫。
1干细胞概念及研究的兴起
干细胞是指具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体。干细胞是机体内存在的一类特殊细胞，它们显著的生物学特性是既有自我更新能力又具有多向分化的潜能。干细胞可分为胚胎干细胞 (ESC)和成体干细胞如造血干细胞、骨髓间充质干细胞（MSCs）、神经干细胞、肌肉干细胞、成骨干细胞、内胚层干细胞和视网膜干细胞等。细胞工程尤其是干细胞工程的兴起为激光致视网膜伤的治疗提供了一种新思路。干细胞在组织工程及相关领域应用较广，如最近发现老鼠胚胎干细胞可以向神经细胞分化，可以用来治疗帕金森等神经系统的疾病,并且利用这一分化特性可以作为治疗视网膜退化性疾病的无限的细胞资源。 来源于神经，非神经和胚胎细胞可以使用于潜在修复破损的视网膜，同时通过转分化诱导存在于眼部组织中视网膜再生细胞如视网膜色素上皮，色素睫状缘上皮及Müller神经胶质上[1]。在体外不同条件下MSCs可以定向地被诱导分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、肌腱细胞、神经元等不同的细胞。体内实验也证明MSCs可分化为骨、软骨细胞、神经元、肝脏卵圆细胞及心肌细胞等[2]。许多研究者试用了多种干细胞以期解决视网膜损伤的修复问题，如胚胎干细胞、胚胎视网膜祖细胞、成体哺乳动物眼干细胞[3]等。近年来的研究成果给人们显示出干细胞的美好应用前景，关键在于如何确定干细胞是否存在于所有的组织中，如何改进干细胞的分离和培养技术并掌握干细胞向特定谱系定向分化所需的标志物等。尽管如此，使用干细胞的危害性也需提出，尤其是人类的ESC细胞显示出其具有致瘤性，说明未分化的ESC细胞在进行移植前必须完全清除掉。它既存在于胚胎发育段。如胚胎干细胞及某些器官前体细胞。也存在于发育成熟的个体的某些部位，如造血干细胞、骨髓间充质干细胞、视网膜干细胞及肌肉卫细胞等。
2与视网膜相关的干细胞
2.1胚胎视网膜祖细胞 现今胚胎干细胞移植在眼科的应用尚处于实验研究阶段，其在视网膜变性疾病及视神经病变治疗中的应用潜能渐成为研究的热点。微环境中各种因素影响胚胎干细胞(ESC))的分化发育，多种细胞因子对干细胞的生存、增殖和分化具有重要的调控作用[4] ，可以形成跨细胞效应；细胞与细胞之间的相互作用对干细胞命运的调控也具重要意义。而细胞间直接作用对胚胎早期发育形成三胚层的过程的调节作用尤为突出。David等[5]则证明胚胎视网膜包含着在体外具有干细胞分化潜能的祖代细胞，这些细胞除可增殖并表达神经外胚层标记外，还具有多向分化潜能：如在特定条件下它还可以分化成光感受器细胞。这说明此祖代细胞可以用作细胞移植治疗视网膜疾病。Qiu等[6]利用David方法使移植的祖细胞表达了光感受器细胞特有的标记，这进一步说明视网膜祖细胞具有分化成感受器细胞的能力。越来越多的动物实验表明成体干细胞具有横向分化潜能,其自身的应用优势为难治性眼科疾病的治疗提供了新的途径. 俞海燕等[7]通过来自16～20wk人胚胎的视网膜干细胞进行无血清体外培养,并分别进行有血清条件下体外诱导和用含视网膜色素上皮的眼杯模拟体内条件诱导的观察,采用免疫荧光法检测干细胞和视网膜终末细胞表面抗原的表达,采用实时荧光定量PCR法检测诱导前后细胞nestin基因在mRNA水平的表达差异,结果显示:诱导后细胞nestin基因表达量较诱导前细胞明显降低,同时推知RPE可以促进体外培养的视网膜干细胞向视杆细胞、无长突细胞、双极细胞、节细胞和Müller细胞分化。此外，原始的胚胎视网膜细胞移植可以作为保护和恢复视网膜的屏障[8］。Warfvinge等［9］用具有生存，整合及分化功能的老鼠视网膜细胞移植到成年猪的视网膜下，整合到损伤区域的视网膜祖细胞移植物能够生存很长时间并展示形态学分化，这一系列工作证明了视网膜祖细胞作为移植供体的可能性。利用胚胎干细胞在体外可以大量扩增并可诱导成为神经细胞的特性，将其与视网膜神经节细胞或视网膜感光细胞等进行融合，获得全新的既能在体外扩增又具有神经节细胞或感光细胞特性的子代细胞，不失为视功能保护研究的一条新途径。但祖细胞的移植是否能够帮助修复受损的视网膜?受损的视网膜如果被修复是否伴随着视功能的恢复?这些问题目前还没有答案。
2.2成熟个体的视网膜干细胞 以前人们一直认为成年哺乳动物视网膜没有再生功能，但Vincent等[3]发现在成年小鼠眼内存在干细胞，为视网膜再生提供了可能。单纯色素睫状缘细胞充当了这一角色，它在体外可分化成视网膜特殊的细胞类型。如视杆细胞、双极细胞和Müller细胞。成人视网膜干细胞分布于有色素的睫状缘而不存在于视网膜色素上皮，表明这些细胞与其他非哺乳类脊椎动物胚胎的眼区有同源性。但眼内存在的干细胞能否作为移植供体仍不清楚，至少在临床上同种异体免疫排斥反应会成为治疗的障碍。通过研究成熟个体的视网膜祖细胞发现它可以代替视神经[10]及光感受器，这给视网膜病变和瘢痕变性，包括青光眼及老年性黄斑病变等在内的以视网膜神经元大量死亡为病理特征的不可逆性致盲眼病[11]，提供有效治疗前景。通过移植干细胞，使其整合入视网膜各层并诱导其增殖分化为目标细胞，补充缺失的视网膜神经元,重建视网膜功能，将给不可逆性致盲眼病患者复明带来希望。
2.3人视网膜中的神经干细胞 最近美国ARVO会议上有成年灵长类视网膜中存在干细胞的报道。同时在胚胎及成体中枢神经系统中已证实神经干细胞(NSCs)的存在[12]。从比较解剖学看，成年鸟类视网膜中度损伤后，部分再生的细胞则来源于Müller细胞，而鱼类、两栖类的视网膜周边部存在睫状体边缘带(CMZ)，这里的细胞也具备NSCs的特征[13，14]。现已发现哺乳类的视网膜也具有这种细胞[15] 。通过选择性地破坏视网膜神经元后， Raymond等[16]观察发现除了周边区视网膜再生外，在视网膜中央也有活跃的再生现象，且不依赖于周边干细胞，马静等[17]则认为在0～3岁人视网膜中存在一种表现出神经干细胞特性的细胞，这些细胞可能是胚胎发育过程中偶然的残留，抑或为局部微环境中潜藏的细胞。张良等[18]发现视黄酸可以诱导大部分细胞成为神经细胞，在视黄酸和视网膜细胞共培养诱导条件下，可以获得更为纯化的形态一致的神经样细胞，部分诱导细胞表达视网膜细胞的特性，这给今后ESC在视网膜中移植以治疗视网膜变性性疾病中提供了有效。由于视网膜干细胞具备自我更新能力及多分化潜能,有望用于退行性神经疾病如:视网膜色素变性、老年黄斑变性、晚期青光眼等的细胞替代治疗或药物、基因治疗的载体。
3一些具有潜在治疗视网膜病变能力的干细胞
世界上每年有数百万人患有组织缺失或终末器官衰竭，随着移植方法的改进及抗排斥药物的广泛应用，异体移植救治或改善了无数的生命。但是，即使是在眼这样具有血一眼屏障的器官里，异体移植都会形成玫瑰花结样的结构，因此排斥反应也是一个不可忽视的问题。自体干细胞经适当体外处理后，可作为移植供体用于许多先天及后天疾病，从最大程度上避免了移植排异反应。视网膜移植治疗视网膜疾病已由原来的单纯视网膜色素上皮细胞、视网膜感光细胞的细胞悬液移植到如今的全层视网膜移植，移植的视网膜已可以达到完美的结构重建，但要达到功能重建还存在许多复杂和关键的问题。
3.1骨髓间充质干细胞 骨髓中含有可分化为外周循环血细胞的造血干细胞早已经为人们所认可。最近的研究表明，骨髓中还存在一种可以向多种非造血细胞分化的干细胞。由于体外培养的这些细胞易于粘附塑料培养板并形成纤维样的集落，所以被视为贴壁细胞或CFU F。它们还可以形成对造血干细胞生长有支持作用的滋养层，而骨髓中复杂的支持结构也起源于这群细胞，因此又被称之为骨髓基质细胞。后来，人们发现它们还可以分化成多种间质样的细胞，故又将其称为骨髓间充质干细胞或骨髓间充质祖细胞(MSCs)。而均一的MSCs的获得和鉴定为深入研究的开展奠定了必要的基础。体外诱导骨髓间充质干细胞向多种间质样的细胞分化的实验报道越来越多。张杰等[19]证实了MSCs能够在视网膜下存活并能与原视网膜结构相融合，尚不能判断形成的视网膜样结构是否具有神经细胞的特性，以及这种结构是否能够建立正确的神经传导。但是如能证明新形成的视网膜具有感光功能，MSCs将成为视网膜移植高纯度、具有发育潜能的视细胞供体，在视网膜变性疾病及视神经病变中将有广泛的应用潜力。Qu等[20]则认为溴脱氧尿苷有增加人类骨髓衍生干细胞的潜能，它的这种潜能可以通过自体细胞疗法用在神经学上和眼科视网膜病变。Zhang等[21]通过研究发现移植入小鼠视网膜的MSCs的比例说明MSCs的衍生细胞虽然不能精确表达神经相关的蛋白质，但能够分化成体内类似视网膜结构及区别正常和被激光损伤的视网膜成分[22]，并有帮助恢复其损伤和ERG b波的价值[23]。体外扩增的MSCs在加入胰岛素、茚甲新、地塞米松和l甲基-3-异丁基黄嘌呤等药物和试剂培养时可以分化成脂肪细胞；在向软骨的分化实验中通过离心的方法使MSCs形成球型细胞团，加入转化生长因子a3后，可以检测到关节软骨所特有的II型胶原蛋白；另外，在地塞米松、a甘油磷脂、抗坏血酸盐和100mL体积FBS的共同影响下还可以分化为骨。体内实验大多数以小鼠为实验材料，将正常供者小鼠MSCs大量回输表达突变的胶原蛋白的弱小小鼠体内，结果显示受者小鼠体内的骨、软骨和脑组织30％的细胞被供者的细胞代替，这一实验结果为临床试验奠定了基础。此外，Caplan等[24]从变性关节炎患者的骨髓中分离出MSCs。经体外培养后直接输注入患者的关节中形成新的关节面。从而加速了关节的恢复。值得注意的是,当回输MSCs时，在脑部也发现有少量的早期星形神经胶质细胞来源于MSCs，这说明MSCs至少还存在着向其他类型细胞分化的潜能。更有人提出，从骨髓提取出来的一群被称为SP的细胞是成体所有已分化细胞的干细胞的假设。可以预见，随着对MSCs研究的深入MSCs必将在细胞治疗和组织工程领域扮演着举足轻重的角色。
3.2骨骼肌卫星细胞 骨骼肌卫星细胞首先在青蛙的肌肉细胞中被发现，后来又在鸟类和哺乳动物中得到证实。卫星细胞通过FGF或aFGF介导成体的肌肉生长,是成人肌肉形成的主要方式。它通常处于静止状态，但在负重或损伤时变的活跃。长期以来被认为是专一提供骨骼肌在出生以后的生长修复的．但最近在小鼠身上发现，从骨髓中高度纯化的造血干细胞能够参与肌肉的再生，更令人惊喜的是直接从骨骼肌中纯化的干细胞静脉注射小鼠后．有效地重建了造血系统，同时也参与了肌肉的重建。肌肉干细胞的可塑性引出了一个问题，即肌肉来源的干细胞和骨骼肌卫星细胞之间的关系究竟如何?不仅如此，造血细胞具有成肌细胞的能力也提醒研究者探究卫星细胞的胚胎起源。最近的研究进展表明，有一群卫星细胞在胚胎发育上是起源于胚胎脉管系统的。这些事实证明，成人骨骼肌中存在着多分化潜能的干细胞。包括卫星细胞在内的组织特异性干细胞可能有着共同的胚胎起源，并应不同的环境刺激而向不同的方向分化。有研究表明，肌肉细胞不仅有向造血细胞分化的倾向，还有向SP细胞分化的趋势。
3.3嗅神经干细胞 多年来，人们认为哺乳动物的神经系统是不可再生的，丢失或损坏的成年神经细胞不可能被取代。最近，家发现，神经系统中有3个区域的神经先驱细胞或干细胞在成年生命体中可再生神经细胞[25]。这3个区域分别是视网膜、喙状前脑中的迁移细胞（中胚层起源）和嗅觉系统的基细胞（外胚层起源）。科学家从这3个区域也许可以找到取代成年大脑中丢失或损坏的神经细胞的线索。现在，Hansel等[26]发现，神经肽Y可以促进嗅觉系统上皮中的神经干细胞的分裂。而视网膜作为脑组织的延伸,存在着大量神经干细胞,在内外源性因子机制及各基因调节机制作用下,增殖分化为视网膜各型神经元及神经胶质细胞。从上述细胞的转化来看，微环境对于细胞的分化起着至关重要的作用。而且，如果SP细胞真象假设的那样具有分化的全能性。那么，是否这些干细胞在体外培养过程中受到某些刺激而转化成了SP之后便能分化成视网膜各层细胞?
总之，在干细胞治疗视网膜疾病研究的数十年中，经动物证实可供进行移植实验的供体干细胞种类较多，而且随着研究的不断进步，还会有新的干细胞被发现。究竟这些干细胞中间哪一种更适合进行视网膜病的治疗,我们将拭目以待。
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