缺氧诱导因子－1α在早期糖尿病大鼠角膜上皮细胞中的表达
作者：宋虎平，惠延年，王丽丽，韩晓霞，王海燕
【摘要】 目的：观察缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）在早期糖尿病大鼠角膜上皮细胞中的表达以探讨其在糖尿病性角膜上皮细胞病变发生及中的作用。 方法：用链脲佐菌素（STZ）制作糖尿病大鼠模型，在制模成功后1，2，4，6，8，10及12wk取眼球组织，以年龄匹配正常大鼠作为对照组，分别以免疫组织化学染色及Western blotting方法检测角膜上皮细胞中HIF-1α表达的位置及表达量。结果：糖尿病模型诱导成功后1wk，角膜上皮细胞中即有HIF-1α表达，主要位于基底细胞的细胞核内，4wk时阳性细胞数大于1wk（21.80±1.93 vs 15.30±2.05），6～10wk达到高峰（6，8和10wk分别为49.00±2.82，90.80±4.23, 51.40±5.21），12wk下降（14.40±2.06）。Western blotting分析显示HIF-1α蛋白表达模式与免疫组织化学相似，1wk时即有表达，6～10wk达到高峰，12wk下降。 结论：HIF-1α在早期糖尿病角膜上皮细胞中的瞬时高表达而不是持续表达，可能是早期糖尿病角膜上皮细胞病变的原因。
【关键词】 糖尿病并发症
0引言
糖尿病角膜上皮病变是糖尿病的一个重要的并发症，其主要特征是角膜上皮细胞黏附、移行、分化和更新的能力下降，临床表现为角膜上皮细胞缺损、反复发作的角膜上皮糜烂、敏感性下降、再上皮化延迟、损伤修复能力异常及对外伤、溃疡和水肿的易感性提高[1]。角膜上皮细胞外基质和基底膜成分及细胞表面整合素受体之间的相互作用在角膜上皮细胞黏附、移行、分化和更新的过程中起着关键作用。糖尿病患者角膜上皮细胞表面整合素表达下降可能是其发生角膜上皮细胞病变的分子基础[2]。缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）是机体适应氧环境的主要转录因子，在缺氧状态下迅速聚集在细胞核内，与HIF-1β结合，改变包括iNOS、内皮素－1、血管内皮细胞生长因子（VEGF）和血红素生成素（EPO）等基因的表达[3]。HIF-1α的激活可能通过促进新生血管形成，增强血红素合成等机制，减少缺氧对机体造成的损伤。在缺氧的胎盘滋养层干细胞、白细胞及小肠癌细胞中，HIF-1α也可以上调细胞表面整合素的表达，促进细胞的黏附、移行和分化[4-6]。糖尿病状态下角膜处于缺氧环境中[7]。虽然有大量证明HIF-1α 在糖尿病其他并发症如糖尿病视网膜病变和糖尿病神经病变中起着重要作用[3,8]，但是关于其在糖尿病角膜上皮细胞病变中的作用未见报道。我们研究HIF-1α在早期糖尿病大鼠角膜上皮细胞中的表达，以确定其在糖尿病角膜上皮细胞病变中的作用。
1材料和方法
1.1材料 雄性SD大鼠，体质量约180g，购自第四军医大学实验动物中心。空腹24h后一次性ip链脲佐菌素（Sigma, USA）65mg/kg（溶于10mol/L柠檬酸缓冲液中，pH4.5）诱导糖尿病模型，正常对照组注射柠檬酸缓冲液，注射后24h血糖浓度大于11.0mol/L认为糖尿病诱导成功，随机分为糖尿病1，2，4，6，8，10及12wk组。年龄匹配的正常大鼠作为对照组。普通饲料喂养。动物处死时测量血糖和体质量。血糖水平低于11.0mol/L的动物排除在实验之外。根据实验分组，于相应时间点腹腔注射过量乌拉坦处死动物。每组取4个眼球，迅速置于眼球固定液（第四军医大学西京眼科马吉献惠赠）中24h，常规石蜡包埋切片备用于免疫组织化学染色。用于Western blotting分析的眼球则在摘除眼球后迅速于冰上沿角膜缘分离完整角膜之后置于液氮中保存备用，每组12个。
1.2方法 取对照组及各实验组石蜡切片，常规脱蜡至水，30mL/L H2O2去除内源性过氧化物酶，抗原修复，正常山羊血清室温封闭30min，加HIF-1α mAb（1∶500, Chemicon, USA）4℃过夜，PBS洗3次，加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG工作液（DAKO，USA）37℃孵育1h， PBS洗3次，每次10min, DAB（Sigma）显色。另取液氮中冻存的角膜，机械分离上皮细胞层，加入细胞裂解缓冲液（20mol/L HEPES, pH7.5, 10g/L Triton X-100, 1mol/L EDTA, 0.1mol/L NaCL）, 临用前加蛋白酶抑制剂混合物［（1mg/L leupeptin, 0.5mg/L aprotinin, 0.1mg/L PMSF）, Pierce, USA］, 冰上裂解30min之后，4℃, 12 000r/min, 离心20min, 取上清，BCA试剂盒（Pierce, USA）蛋白定量。上样缓冲液调节蛋白浓度，煮沸10min, -20℃冻存。取80g/L SDS-PAGE凝胶，每一泳道蛋白总量为120μg，电泳后，转印至PVDF膜，100g/L脱脂奶粉4℃封闭过夜，加HIF-1α mAb（Chemicon,USA, 1∶750）和β-actin抗体（北京中杉，北京，1∶500），37℃1h，TBST洗3次，加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG（1∶5 000）37℃1h, TBST洗3次，每次10min, ECL发光（Pierce, USA）。实验重复3次。
统计学处理：采用UTHSCSA Image Tool Version 3.0 Final软件对免疫组织化学染色结果进行分析；用Sigma Gel 1.0和Sigma Plot 4.0软件对Western blotting结果进行分析。采用ANOVA的SNK－q检验对实验数据进行统计分析。P＜0.05认为有统计学意义。
2结果
STZ诱导糖尿病模型的成模率在90％以上。模型诱导成功后动物有明显的多饮多食多尿症状，体质量增加缓慢。各糖尿病组动物血糖水平明显高于正常对照组。各个糖尿病组动物体质量明显低于年龄匹配的对照组（资料未显示）。
2.1免疫组织化学染色 免疫组织化学染色显示正常对照组大鼠角膜不表达HIF-1α，而糖尿病组大鼠在糖尿病诱导成功后1wk即有HIF-1α的表达，表达位置主要在基底细胞的细胞核内。随着糖尿病时间的延长，阳性细胞数量逐渐增加，并且在表层上皮细胞中也出现HIF-1α的表达。采用UTHSCSA Image Tool Version 3.0 Final软件对免疫组织化学染色结果进行分析。随机取10个高倍镜视野计数棕黄色阳性细胞数，取平均值，为每组的平均阳性细胞数，记为均数±标准差。1wk的平均阳性细胞数为15.30±2.05，2wk组角膜HIF-1α阳性细胞数和1wk组相比无显著性差异（15.30±2.05vs 17.20±2.69，P＞0.05）。4wk组阳性细胞数量开始上升, 阳性细胞为21.8±1.93，6～10wk达到高峰，阳性细胞比例分别为46.00±2.82，90.80±4.23和51.40±5.21，之后开始下降，12wk下降至15.60±2.06，和1wk时水平相当。将1，2，4，6，8，10和12wk之间阳性细胞数经SNK－q检验后发现，除1，2，12wk之间两两比较差异无统计学意义外（SNK－q检验，P＞0.05），其他各组之间两两比较的差异有统计学意义（SNK－q检验，P＜0.05，图1）。
2.2 Western blotting 用Western blotting分析糖尿病大鼠角膜上皮细胞HIF-1α蛋白表达量。结果显示：正常大鼠角膜上皮细胞中未发现HIF-1α蛋白表达，糖尿病大鼠角膜上皮细胞在糖尿病诱导成功后1wk即有HIF-1α的表达，4wk开始明显上升，高峰期在6～10wk，随后开始下降。用Sigma Gel 1.0和Sigma Plot 4.0软件对Western blotting结果进行分析后显示：2，4，6，8，10和12wk组HIF-1α灰度分别是1wk组的1.1，2.1，4.3，5.9，5.0和1.2倍，经SNK－q检验后发现，除了2和12wk之间比较差异无统计学意义外（P＞0.05），其他各组之间两两比较的差异均有统计学意义（P＜0.05，图2）。
糖尿病1wk角膜中即可发现阳性细胞，主要位于基底细胞层的细胞核内。2～4wk持续表达。6～10wk达到高峰，12wk下降。EP：角膜上皮细胞层；S：角膜基质层
图1 糖尿病大鼠角膜HIF-1α表达SABC×200
A 10wk正常大鼠和1～12wk糖尿病大鼠角膜上皮细胞经SDS-PAGE凝胶电泳及HIF-1α免疫印迹分析后ECL发光图上端数字分别表示糖尿病诱导成功后时间；c-10表示10wk正常对照组大鼠；B HIF-1α蛋白表达水平灰度分析图结果表示各实验组比1wk组灰度的倍数
图2 糖尿病大鼠角膜上皮细胞HIF-1α表达Western blotting
3讨论
本研究的目的是探讨HIF-1α在糖尿病大鼠角膜上皮细胞中的表达位置及表达量随时间变化的规律以确定其在糖尿病角膜上皮细胞病变发生及发展中的作用。结果显示糖尿病诱导成功后1wk角膜上皮细胞中即可发现HIF-1α阳性细胞，主要位于基底细胞的细胞核内。糖尿病4wk动物HIF-1α阳性细胞数量明显增加，6～10wk达到高峰，12wk开始下降。糖尿病大鼠角膜上皮细胞HIF-1α蛋白表达模式与免疫组织化学染色相似，1wk即有表达，4wk上升，6～10wk达到高峰，之后下降。HIF-1α是机体适应氧环境的主要调节因子。缺氧是其重要的激活因素。同时一些生长因子和细胞因子如胰岛素样生长因子－1（IGF－1）、内皮素－1（ET－1）、白细胞介素－1（IL－1）和胰岛素等非缺氧因素也是HIF-1α的激活因子[9]。角膜在糖尿病状态下处于缺氧状态，随着病程的延长缺氧会逐渐加重[7]。这可能是本文中HIF-1α在角膜上皮细胞中表达并且随病程延长表达逐渐增强的原因。缺氧状态下组织细胞HIF-1α表达的意义在于通过激活其下游基因如VEGF和EPO等基因的表达，减少缺氧对组织细胞造成的损伤。另外，实验研究发现糖尿病角膜上皮细胞中尤其是基底细胞中IGF-1和ET-1的表达显著高于非糖尿病角膜，这些因素也可能会促进糖尿病状态下角膜组织表达HIF-1α[7,10]。
关于HIF-1α在糖尿病视网膜病变中的作用已有大量报道[8]，但是关于HIF-1α在糖尿病角膜病变中的研究未见报道。我们研究发现，HIF-1α在角膜上皮中的表达主要在基底细胞细胞核内，和缺氧状态下的表达位置一致[11]。但是HIF-1α在糖尿病进展过程中并不是持续高表达的，在经过6～10wk的高峰期后开始下降。造成这种现象的原因可能和糖尿病的高糖状态有关。因为高糖培养状态下人皮肤微血管内皮细胞比正常糖浓度培养细胞表达HIF－1α蛋白水平低，说明糖尿病高糖代谢紊乱状态可能会影响HIF－1α的反应[12]。缺血情况下，糖尿病大鼠心梗面积大于非糖尿病大鼠，同时心脏组织中HIF－1α的mRNA表达水平低于非糖尿病大鼠，也证明高糖对HIF－1α蛋白表达有抑制作用[13]。Makino等[11] 在正常大鼠角膜中发现角膜上皮细胞有低水平的HIF－1α的mRNA表达，而本实验中在各个时间点的正常大鼠角膜中都未发现HIF－1α蛋白表达。出现这种差异的原因可能和实验方法不同有关。
VEGF是一个经过广泛研究的HIF－1α的下游基因。VEGF的重要作用是促进血管内皮细胞增殖从而诱导新生血管形成。在一些非内皮细胞中也发现了VEGF及其受体，如视网膜节细胞、视网膜色素上皮细胞、角膜上皮细胞和巨噬细胞等[7]。说明VEGF是一种重要的细胞存活因子[14]。糖尿病患者角膜上皮细胞VEGF的mRNA和蛋白水平均高于正常对照组[15]，这些高表达的VEGF可以减轻糖尿病对角膜上皮细胞的损伤[7]。由于HIF－1α是VEGF的重要调节因子，糖尿病状态下角膜上皮细胞中VEGF的上调可能和HIF－1α的高表达相关。早期糖尿病状态下角膜组织HIF－1α短暂高表达而不是持续高表达，可能会影响角膜上皮细胞VEGF的表达水平，降低角膜上皮细胞对糖尿病代谢紊乱损伤的适应能力，导致上皮细胞对手术、外伤等损伤的敏感性提高。糖尿病角膜上皮细胞病变的另一个重要特征是角膜上皮细胞黏附性下降[1]。细胞外基质及基底膜成分与其细胞表面的整合素受体之间的相互作用是决定细胞黏附的重要因素。通过对人角膜组织的研究发现糖尿病患者角膜上皮细胞表面整合素水平低于正常对照组[1]。HIF－1α有调节细胞表面整合素的作用，通过调节整合素的表达，促进细胞的黏附移行，在胎盘着床、肿瘤转移和白细胞浸润过程中起着重要作用[4-6]。大鼠角膜组织在糖尿病3mo后出现上皮细胞黏附松弛[16]，细胞表面整合素表达下降[17]，可能与3mo时HIF－1α表达下降有关。
我们首次报道了在糖尿病状态下角膜上皮细胞中HIF－1α的表达，发现在早期糖尿病状态下，角膜上皮细胞HIF－1α表达短暂升高，说明HIF－1α在糖尿病状态下有适应性升高，但这种适应性反应是不充分的，不能提供足够的新生血管形成因子以减少组织的损伤，并且可能下调角膜上皮细胞表面整合素表达。同时说明在早期糖尿病状态下及时补充HIF－1α下游调节蛋白如VEGF可能有助于减轻糖尿病角膜上皮细胞病变的。
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