促红细胞生成素对视网膜保护作用的研究进展
【摘要】 红细胞生成素是由肾脏分泌的内源性细胞因子，近来研究发现，视网膜也存在红细胞生成素及其受体，并在视网膜缺血缺氧以及光损伤等均起保护作用。本文对红细胞生成素及其受体的产生、结构及其在视网膜缺血缺氧中的保护机制进行综述。
【关键词】 红细胞生成素 视网膜 缺血缺氧 神经保护
Study advance on the protective effect of erythropoietin on retina
Abstract Erythropoietin is well known due to the important function in the erythrocytopoiesis , however , the recent studies have found that erythropoietin and its receptors also exist in retina and play a protective role during hypoxia/ischemia and light-induced retinal degeneration etc . The article reviews the development of erythropoietin and its receptors，structure and protective mechanism in retina .
· KEYWORDS: erythropoietin; retina; protection
0引言
许多视网膜、视神经疾病如老年性黄斑变性、视网膜脱离、视网膜色素变性、视网膜功能不良性疾病、视神经损伤等，它们的共同病理机制是视网膜神经节细胞、光感受器细胞等神经元的凋亡，最终导致视力的丧失，因而，寻找视网膜视神经保护药物具有重要意义。本文就促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）及其受体的产生、结构、对视网膜保护机制以及临床应用前景作一综述。
1EPO以及EPO受体的分子结构
EPO是一种含唾液酸的酸性热稳定(80℃)糖蛋白，由165个氨基酸组成，来源于肾脏及胎肝,在缺氧情况下，EPO可在肾外更多的器官中表达，天然存在的EPO 有两种类型，α型和β型。两种类型的生物学特性、抗原性相同，主要区别在于碳水化合物含量不同。传统上认为EPO 是一种血细胞因子，可以促进造血祖细胞的增殖与分化，然而，近年来许多研究表明EPO具有神经营养活性，EPO可刺激神经祖细胞发育并防止胚胎脑凋亡。EPO的生物作用是通过相应靶细胞膜表面受体介导的。EPO受体属于细胞因子受体超家族成员，其基因定位于染色体19q13.3，有8个外显子，编码一分子量为66kDa、由507个氨基酸组成的I型跨膜糖蛋白，包含胞外区、跨膜区和胞内区，胞外区具有与其他在细胞表面正确折叠和表达所必需的、高度保守的WSXWS（tryptophan-serine-x-trypto-phan- serine）序列和两对半胱氨基酸残基。在细胞质的近膜区也有两个高度保守序列box1和box2，对于EPO受体形成折叠非常重要。一分子EPO可与细胞表面的两分子受体相结合，其受体结合区域在C末端。Jak2可以和box l区特异性结合并被磷酸化，然后激活一系列激酶和信号转导蛋白。
2 EPO及EPO-R在视网膜中的分布
EPO和EPO-R在胚胎和成年组织中广泛表达，在视网膜的研究中, Bocker-Meffert等[1]通过免疫染色发现EPO-R主要定位于视神经节细胞层，低密度的染色标记存在于内丛状层和外丛状层以及锥体内节部分。用含有特异性阻滞肽的抗EPO-R抗体进行免疫反应也证实了EPO-R在视网膜中的存在，同时Junk等[12]通过使用特异性的多克隆抗体发现EPO and EPO-R表达在正常的视网膜上，免疫组织化学研究定位在视网膜内层，免疫组织化学双标记染色示EPO-R的表达定位在视网膜神经节细胞、无长突细胞和Müller细胞。
3视网膜缺血缺氧时EPO的产生机制
视网膜在正常供氧情况下，低氧诱导因子HIF-1a（hypoxia inducible factor）是HIF的调节亚单位，快速被蛋白酶体很快降解，而视网膜缺血意味着视网膜组织同时缺氧和葡萄糖，此时，首先缺氧的局部组织产生一种转录因子—缺氧诱导因子HIF-1a，HIF-1a稳定，HIF-1a进入细胞核内，进入细胞核与HIF-1b形成异源二聚体，结合到目标基因染色体上缺氧反应元件（hypoxia response element，HRE）结合，启动包括EPO基因在内的一系列基因的转录，如EPO，VEGF，FGF2等，随着EPO的产生增加，EPO-R的表达也明显上调，EPO的信使mRNA被转运到细胞质并且翻译表达EPO蛋白[3]。
4血视网膜屏障对EPO的影响
Grimm等[4]研究EPO对视网膜光化学损伤的保护性研究中，通过实验组小鼠腹腔注射rHEPO 5 000U/kg后通过ELISA分析视网膜rhEPO的水平，注射后2h，100pg视网膜蛋白中EPO的含量可达到（0.74±0.24）mU；4h达到高峰（1.68±0.37）mU，8h降低4倍（0.47±0.13）mU。而对照组小鼠注射生理盐水后，视网膜中未检测到EPO，结果表明rHEPO腹腔注射后可通过小鼠血视网膜屏障进入视网膜组织同时，Brines等[5]报道中枢神经系统毛细血管内皮细胞表面存在大量EPO受体，血液中的EPO与毛细血管内皮细胞表面的EPO受体结合，可启动细胞内吞噬作用，将EPO通过血脑屏障转运至脑组织，由此推测小鼠血液中的rHEPO可能也是通过这一途径被转运至视网膜组织。
5 EPO在视网膜损伤的保护现象
Grimm等[6]利用视网膜光化学损伤的动物模型研究发现，（HIF-1a）促进了EPO的表达，从而对视网膜光化学损伤起保护作用。显示经过低水平氧（60mL/LO2）处理的鼠可防止光诱导的细胞凋亡从而保护视网膜感光细胞结构和功能。与视网膜光化学损伤细胞凋亡相关的细胞因子activator protein-1（AP-1）在低氧处理后没有抑制，缺氧预处理阻止了凋亡晚期的信号级联反应的caspase-1表达，同时低氧上调EPO的表达，EPO蛋白与其存视网膜感光细胞内段的相应受体结合，触发了信号的级联反应，从而抑制感光细胞的凋亡，并且免疫组织化学检查也证实视网膜感光细胞内段有EPO受体，这与EPO在感光细胞有直接的神经保护作用是相一致的。除了内源性EPO具有保护作用，rHuEPO也具有保护视网膜感光细胞免遭光损伤的作用。
EPO对视网膜神经节细胞也具有神经保护作用。Junk等[7]发现在急性视网膜缺血再灌注损伤动物模型中缺血上调了视网膜EPORmRNA的表达，缺血后l2h开始上升，72h达到高峰，是正常的4倍，而EPO的表达呈下降趋势，48h后下降52%。在缺血前24h预或缺血时立即腹腔注射rHuEPO有助于视网膜功能的恢复，并发现TUNEL（原位末端标记物法）阳性细胞减少，而缺血后用rHuEPO无效，提示EPO通过抗凋亡机制对急性视网膜缺血再灌注损伤具有神经保护作用，外源性全身应用EPO可以挽救损伤的神经元。同时，在缺血再灌注模型中，通过使用可溶性的EPO受体，通过对鼠的ERGb的检测，与对照组相比较，使用可溶性的EPO受体组的b波明显减少，提示加重了视网膜的缺血损伤效应。
EPO与视网膜神经节细胞的轴突生长有关，它能够促进视网膜神经节细胞轴突的生长。Bocker-Meffert等[8]在生后鼠视网膜组织培养时分别加入EPO，血管内皮细胞生长因子（VEGF）呈剂量依赖性促进视网膜神经节细胞轴突的生长，当EPOR抗体加入培养基以阻断EPO的作用时其促轴突生长作用被抑制；提示EPO不仅有神经保护作用，而且在缺血视网膜中有促神经再生的功能。
EPO还对视神经损伤后的视网膜神经节细胞的退行性改变有促进其恢复的作用，Alexandra Kretz等[9]研究发现使用转基因大鼠tg21，它能在神经细胞里优先表达人类EPO，在体外实验中，对视神经损伤后视网膜细胞培养，在培养液中加入EPO刺激神经节细胞的再生， 与未使用EPO的对照组相比，应用10到1 000U rhEPO时，能使总的轴突增加到8.31倍,从10～1 000U的浓度不同时它刺激RGCs轴突生长外展长度和数目都成比例,其结果提示EPO能促进RGC的再生并呈剂量依赖性。同时,分别对视神经轴突损伤后大鼠在0，3，6，9d给予玻璃体腔内重复注射EPO后对其进行视网膜细胞培养,结果也发现EPO能促进神经节细胞的再生轴突长度5.7倍和数目2.16倍。提示EPO可以刺激神经节细胞轴突再生,发挥着神经营养的作用。Weishaupt等[10]建立了轴突损伤模型, 在体外通过应用EPO阻止了缺乏神经营养因子小鼠的RGCs死亡，在体内阻止了GCs的轴突损伤，EPO神经保护效应与剂量呈钟型的剂量反应关系，进一步证明EPO对横断轴突后慢性中枢神经元凋亡有保护作用。最近也有报道，全身给予EPO治疗光损伤性视网膜变性或遗传性视网膜色素变性，发现对视网膜感光细胞有明显的保护作用。
6 EPO对视网膜的保护作用机制
6.1抗凋亡作用 EPO对视网膜抗凋亡的作用机制研究还不是很清楚，但EPO在神经系统内的抑制细胞凋亡的机制可能与红细胞内的机制相同，EPO与EPO受体结合使受体形成二聚体，并通过转磷酸化作用激活Janus激酶2（Janus kinase，JAK2）相关性受体，使受体胞内结构域特异性酪氨酸磷酸化成为细胞内信号转导通路上信号分子的作用位点 J。激活的JAK2可使细胞内多种蛋白酶发生酪氨酸磷酸化，其中也包括EPOR。在JAK2作用下去磷酸化使通路下游的酶失活并下调级联信号，包括促分裂原活化蛋白激酶(Ras—MAPK)途径，磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)途径和信号转导和转录活化因子-5(STAT-5)途径。Ruscher等[11]研究发现通过体外氧葡萄糖剥夺模型也对EPO的阻止凋亡作用及其信号转导机制进行研究，使用了一系列与信号转导相关的拮抗剂，证实了EPO的抗调亡作用，并显示其时间和剂量的依赖性。Chang等[12]研究发现，EPO预处理可减少缺氧诱导的膜磷酯酰丝氨酸残基外显，同时还抑制随后的DNA降解，而这两者均可以独立地导致细胞凋亡，也证实了EPO抗神经元凋亡作用。此外,根据以EPO处理仅5 min即可发挥保护作用这一现象提出了另一可能途径：EPO-EPOR-R-JAK-2-NF-κB。Digicayliogu等[13]的研究进一步表明：Epo可能引起相互独立的JAK-2和核因子-κB(NF-κB)信号通路之间交叉感知。EPO-R介导的JAK-2激活，促使NF-κB的抑制亚单元IκB磷酸化，引起IκB自身失活，从而使NF-κB激活，并向核内易位，导致NF-κB依赖性神经保护基因的转录，包括某些抑制凋亡的因子，如：XIAP和c．LAP2等从而抑制凋亡发生。近来研究发,EPO同时也能抑制与细胞色素C 释放有关的caspase 8，caspase 1，和caspase 3活化酶的活性，增加蛋白激酶(Akt1)的活性，促进凋亡的蛋白磷酸化而保持DNA的完整性。
6.2抗氧化作用 氧化应激是引起神经细胞损伤的重要因素,因而抗氧化作用是EPO发挥神经系统保护作用的另一个机制。NO和谷氨酸的神经毒性作用均与氧自由基产生有关。NO本身即为活性氧Sakanka等 [14]研究表明，EPO具有血小板生长因子相似的作用，可增强超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶等抗氧化酶的活性，从而增强抗氧化活性。Sinor等[15 ]在体外培养的海马神经元实验中证实，EPO可通过上调抗氧化酶的表达而增强抗氧化作用。最近Solaroglui等[16]在胚鼠缺血再灌注损伤模型中观察到。EPO可阻止缺血再灌注损伤后硫巴比妥酸的增加，而硫巴比妥酸代表脑脂质过氧化的程度，说明EPO具有抗脑脂质过氧化的作用。
6.3抗谷氨酸兴奋毒性 谷氨酸是脊椎动物视网膜和中枢神经系统的主要兴奋性神经递质，它作用于谷氨酸受体，介导视网膜神经细胞间的信息传递。然而，谷氨酸又是一种潜在的神经细胞兴奋性毒素，若其过量，将导致神经细胞的死亡。已有研究证实，谷氨酸在视网膜缺血、青光眼、视神经挫伤等过程中起着重要作用,视网膜缺氧缺血时能量代谢障碍导致谷氨酸浓度大量增加，谷氨酸通过与N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体结合导致钙钠通道开放，大量持续钙内流导致细胞内钙超载，从而介导细胞内一系列依赖钙离子的生化反应，最终导致细胞急性坏死，同时也启动细胞凋亡。现在认为谷氨酸兴奋性毒性是触发视网膜缺血性神经元损伤级联反应的最主要因素，一些实验证实，EPO可阻止谷氨酸兴奋毒性作用。Morishita等[17]报道，体外培养胚胎鼠大脑皮质和海马神经元细胞，将这些细胞暴露于谷氨酸处理15min。结果发现，用EPO预处理可预防谷氨酸介导的细胞死亡，向培养基中加入一种Ca2+螯合剂EGTA后保护作用消失。Kawakami等[18]用化学缺血处理小脑颗粒细胞显示，EPO可减少Ca2+诱导的谷氨酸释放。化学缺血致海马神经元死亡的现象可被EPO类似肽1所阻断，结合化学缺血早晚期谷氨酸释放的不同机制，他们认为EPO结合其受体后抑制了谷氨酸的胞吐作用机制。
6.4抗NO作用 在视网膜缺氧缺血中NO过度合成具有神经毒性作用，并介导NMDA受体诱发谷氨酸神经毒性作用致神经节细胞的损伤，可能抑制NO过度合成来减轻神经元损伤。NO产生神经毒作用的可能机制：NO与O2结合产生ONOO，它能氧化蛋白质的巯基，使多种酶欠活，并且可使脂质过氧化，从而严重影响生物膜的功能。另一种机制是NO能引起DNA损伤，并能使线粒体传递受阻，导致细胞能量代谢障碍，最终引起细胞死亡。 Sakanaka等[19]在体内实验证实，提前用EPO可阻止NO生成因子硝普钠(SNP)诱导的NO过度合成，同时加人EPO及SNP不能减轻SNP诱导的神经元损伤,提示在体内EPO通过抑制NO过度合成发挥其神经保护作用。最近有研究发现，EPO可通过Janus激酶(Jak2)和NF-κB(核因子-κB)信号级联来起作用，保护神经元不受由一氧化氮诱导的细胞死亡的损害。
6.5其他可能的抗损伤机制 除以上几种机制外，EPO可能还具有其他抗损伤作用。如Wang等[20]对新生鼠缺血缺氧模型的研究发现，rhEPO处理组HSP27表达增加，而HSP27可减轻损伤和细胞凋亡。
7临床应用前景
虽然有研究证实EPO能够通过血脑以及血视网膜屏障，并且它具有促红细胞生成，神经保护，血管生成素活性功能，但是如果全身应用可能会在视网膜疾病的中产生一些问题,如红细胞增多症，血压增高,长期给予EPO可能会产生一些不良反应，如红细胞增多症，血压增高等。为了防止它的副作用，除了EPO可用于眼部的局部治疗以外，EPO的促红细胞生成、神经保护及血管生成素活性功能的抗原决定簇的识别和分离将为视网膜疾病的治疗开辟新的途径，并可能将其副作用降至最低,仅保留EP0分子的视网膜神经保护活性多肽的重组将会有广泛的临床应用前景。
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