玻璃体条件培养液对人视网膜色素上皮细胞生长活性及细胞周期的影响
【摘要】 目的：探讨在含有人玻璃体的条件培养液作用下体外培养的人视网膜色素上皮（HRPE）细胞形态学、细胞生长活性及细胞周期的改变。方法：将HRPE细胞培养在含100，250，500，1 000mL/L人玻璃体的DMEM条件培养液(VCM)。用倒置显微镜观测细胞的形态学改变，分别用MTT、流式细胞术检测细胞的生长活性及细胞周期的改变。 结果：不同体积分数的VCM使HRPE细胞的形态发生了改变，HRPE细胞出现了多核及更早的脱色素，类似成纤维细胞表型的生长状态。含100，250及500mL/L玻璃体体积的VCM处理后HRPE细胞的增长活性与对照组相比存在显著性差异（P均＜0.01），其中含250mL/L玻璃体的VCM刺激HRPE细胞增生的能力最强。VCM促使更多的HRPE细胞进入了DNA合成期（S期，6％～13％），含250与500mL/L玻璃体体积的VCM使HRPE细胞出现了异倍体的改变。结论：一定体积分数的VCM使HRPE细胞的S期比例增加，细胞增生能力增强。
【关键词】 视网膜色素上皮细胞 玻璃体 MTT 细胞周期 DNA倍体 流式细胞术
Effect of vitreous conditional medium on human retinal pigment epithelium cells' proliferation and cell dividing cycle
AbstractAIM: To investigate the change of cellular morphology, cell proliferative activity and cell dividing cycle in human retinal pigment epithelium (HRPE) cells after treatment of human vitreous conditional medium (VCM). METHODS: HRPE cells were treated with VCM including 100, 250, 500 and 1 000mL/L human vitreous respectively. Cellular morphology, cell proliferative activity and cell dividing cycle changes were observed by invert microscope, MTT assay and Flow Cytometry (FCM) assay respectively.RESULTS: HRPE cells showed polynucleation and pre-depigmenting, fibroblast-like phenotype. For HRPE cells proliferative activity, there was significant disparity between control and experimental group, especially for VCM with 250mL/L vitreous. VCM increased the HRPE cells' proportion of phase S (6％～13％)and heteroploid was found in VCM with 250 and 500 mL/L vitreous. CONCLUSION: VCM can increase the S phase proption in HRPE cells' cell dividing cycle, and increase their proliferative activity.
· KEYWORDS: retinal pigment epithelium; vitreous; MTT; cell dividing cycle; DNA ploidy； Flow Cytometry
0引言
增生性玻璃体视网膜病变（PVR）是裂孔性视网膜脱离手术失败的最主要原因,也是眼外伤、血管性和炎症性视网膜病变的一种结局[1]。它的启动和表现为过度的创伤愈合过程，其基本病理过程是视网膜色素上皮细胞（RPE）的移行、增生，在视网膜前和膜后及玻璃体腔内形成增生膜，最终增生膜的收缩导致牵拉性视网膜脱离，属于增生性疾病[2]。现已有大量关于生长因子，细胞因子通过复杂的信号途径作用于RPE细胞，导致其病理性增生的实验性研究的报道[3]。目前虽已明确，视网膜神经层损伤后造成的RPE细胞与玻璃体的接触是PVR发生的高危因素[4],但玻璃体作用的具体机制仍未明确。有报道表明在PVR这一病理过程中玻璃体液内多种细胞因子的含量发生了改变[5，6]。也有学者发现，PVR患者的玻璃体液能促进增生膜中胶原的合成以及增生膜的收缩，从PVR的不同环节参与疾病的演进过程[7，8]。Norbert等[9]发现RPE细胞接触正常玻璃体后会导致其基因表达的改变。Kirchhof等[10]则发现正常玻璃体液能促进使HRPE细胞的形态学发生改变、增强其迁移及增生能力。
细胞周期（cell dividing cycle）[11]指细胞从一次分裂结束开始生长到下一次分裂终止所经历的过程。细胞周期的概念由Howard和Pelc于1951年首次提出，并将细胞周期分为间期（G0）与分裂期（M期）。间期包括DNA合成前期（G1 期）DNA合成期（S 期）DNA 合成后期（G2 期）。M期又分为前期、中期、后期和末期。Lajtha 还提出细胞周期中存在一个G0期，此期细胞不参加细胞增殖，适当刺激后可以重新加入细胞周期开始分裂。为了进一步明确玻璃体与HRPE细胞的接触在PVR始发中的具体作用，国内外的学者进行了玻璃体对人RPE（HRPE）细胞影响的实验性研究。其中涉及到了形态学[8]，生长活性[8,12]及基因表达改变[9]等方面。然而结论尚不一致，且没有学者对玻璃体作用后HRPE细胞的细胞周期改变进行观察，为此我们采用不同体积的人玻璃体作用于培养的人视网膜色素上皮细胞，观察HRPE细胞的形态学、生长活性及细胞周期的改变，来探讨玻璃体作用后的HRPE在PVR发生中的作用。
1材料和方法
1.1材料 取自医科大学附属第一眼科角膜移植术后的正常供体眼（供体年龄24～36岁，无眼部及全身疾患）。DMEM购自美国Gibco公司，胰蛋白酶及MTT购自Amresco公司，胎牛血清（FBS）购自天津TBD公司，碘化丙啶（PI）购自SIGMA公司。
1.2方法 参照Stramm等[13]的视杯消化法：取供体眼后，庆大霉素8万U浸泡消毒20min，去除晶状体、玻璃体、视网膜神经层。用胰酶消化30min，1 000r/min离心收集细胞，用含100mL/L胎牛血清的DMEM培养液置于37℃, 50mL/L CO2 培养箱培养。80％融合的第3～5代HRPE细胞用于实验。将玻璃体完全去除视网膜及色素组织后收集于15mL无菌离心管中。0℃,10 000r/min离心30min，0.22μm微孔滤膜过滤，深低温冰箱-78℃备用保存。将培养的HRPE细胞加入VCM后用倒置显微镜观察细胞的形态学改变并照相。实验组a: 100mL/L的玻璃体＋10mL/L FBS＋DMEM液；实验组b：250mL/L的玻璃体＋10mL/L FBS＋DMEM液；实验组c：500mL/L的玻璃体＋10mL/L FBS＋DMEM液；实验组d：1 000mL/L玻璃体；对照组：平衡盐＋10mL/L FBS＋DMEM液。
1.2.1 VCM作用后HRPE细胞活性 将第3代HRPE细胞消化计数后以2 000个/孔密度接种于96孔板培养24h后加入无血清培养液继续培养6h，之后试验组加入不同体积玻璃体的VCM液，每一浓度重复5孔。继续培养1，3，5，7d取出一个孔板行MTT检验：每孔加入5g/L MTT20μL,继续培养4h,吸弃培养液,加入二甲基亚砜（DMSO）150μL,振荡器振荡10min,待紫色结晶完全溶解后,用酶标测试仪测定吸光度A 值,测定波长为570nm。
1.2.2 HRPE细胞周期的检测 将第3代HRPE细胞加入无血清的DMEM培养12h后，弃无血清DMEM培养液，实验组分别加入含100，250及500mL/L玻璃体的VCM液继续培养48h,对照组加入平衡盐溶液继续培养48h。胰酶消化后通过400目的筛网制成单细胞悬液，离心，PBS洗涤1次后750mL/L乙醇固定，加入PI染液1mL,轻柔吹打后混匀，闭光染色20min，流式细胞仪测定细胞周期。
2结果
2.1 VCM对培养的HRPE细胞形态学的影响 对照组的RPE原代细胞呈扁平不规则多角形，可见清晰透明的圆形单核或双核，细胞内含有较多的色素颗粒，传代至3～4代后细胞内无明显的色素颗粒，细胞呈梭形或多角形生长。加入100，250及500mL/L的VCM后，RPE细胞生长旺盛，分裂象明显，有的细胞呈多核，类似病理性核分裂，并且细胞在第2代就已经脱色素生长，呈分裂过度的老化状态，更快具有纤维细胞的表型（图1A,B,2A,B）。
2.2 VCM对HRPE细胞增生活性的影响 加入100,250及500mL/L VCM后，实验组的HRPE细胞较对照组相比生长明显旺盛，统计学分析均分别有显著性差异 （P＜0.01),这种差异在加入VCM培养3d后出现，并持续到实验观察结束。其中100mL/L与500mL/L VCM组之间相比较并无统计学差异（P＞00.5），但250mL/L VCM组与100mL/L及500mL/L VCM组分别比较差异均有显著差异（P＜0.01），说明其中含250mL/L玻璃体的VCM刺激HRPE细胞发生增生的作用最强。与此相反，1 000mL/L VCM组的HRPE细胞逐渐死亡，细胞数递减，在3，5及7d与对照组相比存在统计学差异(表1)。
2.3 VCM对HRPE细胞细胞周期的影响 与对照组相比HRPE细胞进入S期的比例明显增多，100mL/L VCM组与对照组相比处于S期的细胞比例增加了8.3％（P＜0.01)，同时伴随着G1期比例的下降及G2期比例的升高。尤其值得注意的是在250mL/L及500mL/L的VCM组，有微量异倍体的出现，与对照组及100mL/L VCM组1 000mL/L为二倍体的细胞生长状态明显不同。其中250mL/L VCM组的三倍体较500mL/L VCM组增长了2.4％（P＜0.05），说明250mL/L VCM组使HRPE细胞发生异倍体的能力最强（表2）。
图 1 原代HRPE细胞（倒置显微镜×100） A：加250mL/L的VCM后，见有异倍体的RPE细胞生长,→:三核及多核细胞；B 未加VCM的HRPE细胞生长良好，核分裂相多见，→:双核分裂细胞
图 2 第2代HRPE细胞（倒置显微镜×200） A：加250mL/L VCM的HRPE细胞呈明显老化状态，细胞扁平，无色素，类似纤维细胞；B：未加VCM的HRPE细胞仍含有较多的色素颗粒，细胞呈六角形或梭形生长
3讨论
PVR的特征之一是RPE细胞的病理增生，其发生与RPE细胞增生的调控失常有关。在其发生中RPE与玻璃体的接触是前提条件，为此我们在体外培养的HRPE细胞中加入VCM，来模拟PVR这一病理过程，并研究在此过程中HRPE细胞形态，增殖活性及细胞周期的变化。我们将HRPE细胞分别培养在100，250，500，1 000mL/L VCM中,发现100，250及500mL/L VCM均能使HRPE细胞的增生活性增强，含1 000mL/L玻璃体的VCM则使HRPE细胞发生了凋亡。但在含250mL/L玻璃体的条件培养液中，HRPE细胞的生长活性及细胞周期的变化幅度是最明显的；100与500mL/L VCM对HRPE细胞的生长活性的影响间并不存在明显差异；我们认为上述结果的原因是在体外进行的细胞实验中培养液及血清对细胞生长状态的维持是必不可少的，玻璃体本身并不能维持细胞生存的需要，故1 000mL/L VCM组的HRPE细胞由于缺乏营养而发生了凋亡。而250mL/L VCM组与100mL/L及500mL/L VCM组间的差异提示玻璃体的体积过大或过小均不能使HRPE细胞的病理增生达到最旺盛的水平。这种生长特性也许是因为玻璃体与细胞培养液内的蛋白质，血清存在最适比例，二者在一定范围内存在着平衡，一旦这种平衡被不同程度的打破，细胞的生长状态就随之变化了。在本实验中打破这一平衡的前提条件是在培养液中存在的浓度为10mL/L的胎牛血清，因为Kirchhof等[8]认为，在不含血清的情况下玻璃体并不能使HRPE细胞出现细胞生长状态的改变，而在加入血清之后即使血清浓度低至1mL/L,VCM也能显著的刺激HRPE细胞的增生。我们实验中所选择的血清浓度为10mL/L，在此浓度下HRPE细胞仅能维持存活，并不发生显著细胞生长，也不能形成S形细胞生长曲线,从而排除了血清作为一种丝裂原的干扰。但由于有玻璃体的作用，HRPE细胞生长明显旺盛，提示玻璃体液中含有一些潜在的促增生因子, 它们需血清中某些成分的介导、激活或与其结合而发挥作用。
各种细胞的周期时间不同差异主要在于G1期的长短不同。在离体培养条件下可通过控制外在条件使细胞分裂减慢或停止，但无论采用什么手段均停顿在G1期。这表明细胞一旦通过G1期就注定要完成S,G2及M期。到目前为止，对于玻璃体液作用后HRPE细胞的细胞周期变化还未见报道，我们欣喜的发现HRPE细胞生长状态的改变与其的细胞周期相对应。我们发现，不同体积的VCM作用后细胞进入S期的比例明显增加，提示玻璃体是通过促进细胞进入S期，从而加速细胞分裂而使细胞生长旺盛的，而G2期的比例增加则是继发于S与G1期比例的变化。在人体正常细胞中, DNA是比较恒定的参量, DNA含量随着细胞增殖周期各时相而发生变化。当受到致癌因素刺激时,DNA损伤导致DNA质和量的异常,成为DNA非整倍体细胞,也称异倍体细胞[14]。肿瘤细胞由于调节与生长控制系统障碍而获得无限增殖能力,需要合成大量的核酸以满足其迅速生长的物质需要,故其DNA含量和倍体数有不同程度的改变，细胞的DNA非整倍体是恶性肿瘤的特征性标志之一。值得一提的是在我们的实验组中HRPE细胞有异倍体的出现，表明在我们模拟的PVR病理状态下，HRPE细胞的生长是非常活跃的。洪晶等[15]在外伤后发生PVR眼的原代HRPE细胞的培养中也发现了这种异倍体细胞，说明PVR这种增生性疾病中的关键细胞—HRPE细胞具有一定向肿瘤细胞转化的倾向。但与大部分肿瘤细胞60％～70％左右[16]的异倍体比例相比我们实验所得到的异倍体细胞比例还是相当小的。我们的实验组中异倍体含量也大大低于外伤眼中的20％[15]。认为这与我们试验所使用的诱导条件是有关的，因为我们用的健康人的玻璃体与发生血视网膜屏障严重破坏的外伤眼，视网膜脱离眼的玻璃体内蛋白成分存在差异[5，6]。遗憾的是因为流式细胞术所需的样本量较大，我们没有进行连续时间点的观测及比较。而且由于1 000mL/L VCM组需要在无血清的条件下培养至少48h，此时细胞大多凋亡，与我们所要进行的细胞增生周期分析无关，故未进行该组细胞周期的检测。
综上所述，我们将玻璃体液作用于HRPE细胞后，检测到了HRPE细胞行为学的改变。其生长状态、细胞周期的改变必然有其调控的上游分子信号的改变，究竟是何种信号蛋白参与了这种细胞生长活性改变的调节将是我们需要进一步研究的课题。
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