银杏叶提取物对大鼠慢性高眼压视网膜损伤的保护作用
【摘要】 目的：探讨银杏叶提取物（EGb）对实验性高眼压大鼠视网膜神经节细胞层（RGCL）神经元损伤的保护作用。方法：取健康SD大鼠60只，正常对照组和正常银杏叶组各6只，其余48只采用烧烙法，烙闭大鼠左眼2条浅层巩膜静脉，制作大鼠持续性高眼压模型，从中选出眼压稳定在实验要求水平的大鼠30只，随机分为生理盐水组，治疗A组（每日EGb 50mg/kg）、 治疗B 组（每日EGb 100mg/kg） 、治疗C 组（每日EGb 150mg/kg）、 治疗D 组（每日EGb 200mg/kg），治疗时间为1mo，处死大鼠后做视网膜全层铺片，对RGCL神经元做特异性染色后行神经元计数分析来评估神经元的情况。结果：正常对照组双眼RGCL神经元计数比较无显著性差异（P ＞0.05），正常对照组与正常EGb治疗组RGCL神经元计数比较无显著性差异（P ＞0.05），各浓度EGb治疗组实验眼与正常对照组RGCL计数比较均有显著性差异 （P ＞0.05），各浓度EGb治疗组实验眼与其自身对照眼RGCL神经元计数均有显著性差异（P ＞0.05），各浓度EGb治疗组实验眼与生理盐水组实验眼RGCL神经元计数均有显著性差异（P ＞0.05），治疗A，B，C，D 4组实验眼RGCL神经元计数两两比较均有显著性差异（P ＜0.05）。结论：单独使用EGb对正常大鼠RGCL神经元计数无影响，EGb可对持续慢性高眼压导致的大鼠RGCL神经元损伤提供部分保护作用，且在一定范围内保护作用大小与用药剂量呈正相关。
【关键词】 银杏叶提取物 大鼠 高眼压 神经保护
Protective effect of extract of ginkgo biloba leaves on retinal neuron injury in chronic high intraocular pressure rats
Abstract AIM: To investigate the protective effect of extract of ginkgo biloba (EGb) on retinal ganglion cell layer neuron injury induced high intraocular pressure (IOP) in rats. METHODS: Sixty healthy Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into 3 groups: 6 rats in normal control group, 6 rats in EGb treating normal IOP group, and the other 48 rats were established chronic high IOP models of rats by cauterizing two episcleral veins. Then 30 rats satisfying experimental level were selected and randomly divided into five groups: 6 rats in physiological brine treating group, and the other 24 rats were divided into four experimental groups according to the dose of EGb: group A, EGb 50mg/(kg·d); group B, EGb 100mg/(kg·d); group C, EGb 150mg/(kg·d); and group D EGb 200mg/(kg·d). After the treating time of 1 month, the rats were sacrificed on schedule. Flat preparation of whole retinaes was stained distinctively and neuron counting in retinal ganglion cell layer (RGCL) from both eyes of each rat were performed to evaluate neuron situation. RESULTS: There was no significant difference between the bilateral eyes on neuron counting from RGCL of normal control group (P＞0.05). There was no significant difference between the normal control group and the EGb treating normal IOP group on neuron counting from RGCL of (P＞0.05). The difference was significant between the experimental eyes of every dose group and normal control group (P＜0.05). The difference was significant between the experimental eyes and self-controlled eyes in every dose group (P＜0.05). The difference was significant between the experimental eyes of every dose group and physiological brine treating group (P＜0.05). The difference was significant between the experimental eyes on neuron counting from RGCL of every dose group (P＜0.05). CONCLUSION: EGb has no effect on neuron counting of RGCL when administered alone in normal rats. EGb could partly provide the protective effect on retinal ganglion cell layer neuron injury induced chronic high IOP in rats. The protective effect of EGb will be enhanced according to the increasing dose in a definite range.
· KEYWORDS: extract of ginkgo biloba; rats; high intraocular pressure; neuroprotection
0引言
青光眼是一组由许多因素引起的以视神经凹陷性萎缩和视野缺损为共同特征的疾病，其中病理性眼压升高是最主要的危险因素。所以临床上的治疗方法大都以降低眼压为主，但是眼压降低以后，很多时候视神经仍就进行性损害，视网膜神经节细胞层神经元最终仍将凋亡，因此找到一种能保护RGCL神经元的药物，延缓和减少神经元的凋亡，有效保护视神经，已经成为了当今青光眼研究的焦点和热点。银杏叶提取物（extract of ginkgo biloba leaves，EGb）是从植物银杏叶中提取精制而成的纯天然药物。其主要成份为黄酮类和萜内酯化合物，还含有有机酸、多糖、酚类、氨基酸、聚戊烯醇、甾类和微量元素等。近年来许多研究都已证明EGb具有清除自由基、抑制血小板活化因子、抑制一氧化氮合酶、保护线粒体、抑制谷氨酸毒性等多种生理作用[1,2]，在此基础上我们研究EGb能否延缓或减少持续慢性高眼压对大鼠视网膜神经节细胞层（RGCL）神经元的损伤。
1材料和方法
1.1材料 由南华大学实验动物学部提供健康Sprague- Dawlay大鼠60只，雌性，体质量200～240g，8～12wk龄，经检查无明显歪颈，角膜透明，虹膜血管清晰，瞳孔等大等圆，对光反应灵敏。实验性饲养3d后，连续测量3d眼压，剔除平均眼压高于或者低于大鼠正常眼压波动范围（8～20mmHg）者[3]，挑出合格者纳入实验。银杏叶胶囊（三九药业黄石制药厂，0.15g/粒 ，含银杏叶提取物40mg/粒）。
1.2方法 随机挑选6只大鼠为正常对照组，6只为EGb治疗正常组，其余均采用烧烙法[3]，烙闭大鼠左眼2条浅层巩膜静脉，制作大鼠持续性高眼压模型，右眼不做手术，作为自身对照，观察1wk，在左眼眼压稳定在26mmHg以上者中随机挑选出30只纳入实验，然后随机分为生理盐水组，治疗A组（每日Egb 50mg/kg）、 治疗B 组（每日EGb 100mg/kg） 、治疗C 组（每日EGb 150mg/kg）、 治疗D 组（每日EGb 200mg/kg），每组6只，进行灌胃治疗1mo，每日上午一次性给全部药量。每周监测眼压1次。各组实验期满后取视网膜作全层铺片，甲酚固紫染色后行RGCL神经元计数。每张待测视网膜铺片通过视乳头对称画线，将其分为颞上、颞下、鼻上、鼻下4个象限，并将每一象限视网膜分为3等份，即中央、中间和周边3区，各分区随机取3个点，每点面积为32 500μm2，然后对每点的视网膜神经元细胞进行计数,然后换算成每平方毫米的细胞数(细胞数/mm2),将每区3点细胞密度的均数作为该区的神经元密度。通过形态学（图1）易于辨认RGCL中的血管内皮细胞，具有浓染的核并且无尼氏物质的细胞为胶质细胞，这两种细胞均不纳入RGCL神经元计数。
统计学处理：所有数据均在WindowsXP环境下运用SPSS11.0统计软件处理。统计学方法采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）和t检验,显著性水平为P ＜0.05。
图 1 大鼠视网膜铺片颞上象限（甲酚固紫×400） A：治疗A组；B：治疗B组；C：治疗C组；D：治疗D组
2结果
正常SD大鼠右眼和左眼的RGCL神经元计数分别为(3483.3±21.5)个/mm2和(3491.2±11.9)个/mm2,双眼比较差异无显著性(P ＞0.05)。且从中央区到周边区神经元计数逐渐减少。正常EGb组与正常对照组比较差异无显著性（P ＞0.05），各浓度EGb治疗组实验眼与正常对照组RGCL神经元计数均有显著性差异(P <0.05)，各浓度EGb治疗组实验眼与其自身对照眼RGCL神经元计数均有显著性差异（P ＞0.05），各浓度EGb治疗组实验眼与生理盐水组实验眼RGCL神经元计数均有显著性差异(P <0.05)。治疗A，B，C，D 4组实验眼RGCL神经元计数两两比较均有显著性差异（P <0.05，表1）。
3讨论
青光眼是一种临床常见眼病，也是主要的致盲眼病之一。青光眼导致的视功能损伤是不可逆，后果极其严重。关于青光眼的神经损伤机制主要包括机械学说和缺血学说，眼压升高和视神经供血不足是两大主要原发危险因素，另外兴奋性氨基酸的毒性、氧自由的损害、一氧化氮的增加、自身免疫攻击和生长因子的损耗等都加剧着视神经的变性和凋亡[4]。所以近年来对于青光眼的治疗在加强眼压控制的同时，十分注重在低眼压的情况下对视神经的保护。谷氨酸受体阻滞剂和钙通道阻滞效果好但副作用也大，神经营养因子价格昂贵且又不易通过血脑屏障，为了找到一种价格更便宜、副作用更小、有效保护视神经的药物，我们选择了一种已广泛运用于临床的传统中药EGb，观察其对高眼压所致的大鼠视神经节细胞的保护作用。我们采用的尼氏染色法是一种碱性染料染色神经组织的方法。神经元的胞体中含有大量的核糖核酸，主要以尼氏小体的形式存在，它能与碱性染料结合。尼氏小体在神经节细胞中与一般细胞中的不同之处是其发育良好，我们可以方便的借助染色了的尼氏小体来辨认和鉴定神经细胞的存在与分布。本实验选用甲酚固紫染色后行RGCL神经元计数[5]，操作比较容易，计数准确。克服了经上丘逆行标记RGC的某些缺点[6]，如上丘注射或包埋的部位不能完全准确一致，标记RGC不够均匀，造成RGC计数误差较大，且实验周期长，实验动物可能不能耐受麻醉或手术操作和死亡[7]。
本研究结果显示，正常大鼠右眼RGCL神经元密度是3 483.3±21.5（细胞数/mm2），左眼是3 491.2±11.9（细胞数/ mm2）。单独使用EGb对正常大鼠RGCL神经元密度无影响，也没有见大鼠全身其他不良反应，表明全身使用EGb对正常大鼠是安全的。各浓度EGb治疗组实验眼与生理盐水组实验眼RGCL神经元计数均有显著性差异（P＜0.05）说明EGb起到了RGCL神经元的部分保护作用。治疗A、B、C、D 4组实验眼RGCL神经元计数两两比较均有显著性差异（P ＜0.05）,说明在一定范围内EGb保护作用的大小与用药剂量呈正相关。本实验中尽管证明了EGb对实验性高眼压导致的大鼠视网膜神经节细胞层（RGCL）神经元损伤有部分保护作用，但是由于对其发挥保护作用的单体成分和具体作用机制并未完全阐明，用药后药代动力学和其它暂未能观察到的副反应仍有待进一步研究，要使EGb制剂成为青光眼视神经保护的一线临床用药，需要做更多方面的合作和更的研究。
【】
1邹健,蒋晓燕,徐晓明.银杏叶提取物EGb761神经保护作用研究进展.中草药,2005;36(11):1734-1736
2 Eckert A, Keil U, Kressmann S, Schindowski K, Leutner S, Leutz S, Muller WE．Effects of EGb761 Ginkgo biloba extract on mitochondrial function and oxidative stress．Pharamacopsy chiatry ,2003;36(Suppl 1):S15-23
3杜兆江,刘杰,杨新光,王百忍,段小莉,邝芳,胡丹,朱宝义.浅层巩膜静脉烧烙法诱发大鼠慢性高眼压的研究.第四军医大学学报,2003;24(22):2107-2109
4惠延年.眼科学.第6版.北京:人民卫生出版社,2004:131-147
5杜卓民.实用组织学技术.第1版.北京:人民卫生出版社,1982:133-204
6朱益华,蒋幼芹,刘忠浩,罗学港,吴振中.经上丘逆行标记法视网膜神经节细胞定量的实验研究.眼科研究,2000;18(3):218-220
7王红星.银杏叶提取物EGb761对兔视网膜缺血损伤的保护作用.国际眼科杂志,2005;5(6):1168-1171
