金丝桃素对慢性高眼压兔视网膜神经节细胞保护作用的组织学观察
【摘要】 目的：探索金丝桃素对慢性高眼压兔视网膜神经节细胞的影响。方法：取成年家兔20只，后房内注射α-糜蛋白酶，建立兔慢性高眼压模型。造模成功的兔眼在10d后玻璃体内分别注入金丝桃素0.1mL或生理盐水0.1mL，1次/wk，连续2wk。另用4只正常兔做空白对照。最后光镜电镜观察视网膜神经节细胞的结构变化及视网膜内层平均厚度的变化。结果：生理盐水对照组节细胞数量减少，部分严重变性，染色质边集,线粒体、内质网等细胞器严重肿胀,视网膜内层平均厚度变薄。金丝桃素组节细胞形态结构较生理盐水对照组损伤轻微, 节细胞数量稍有减少,部分变性, 染色质边集，线粒体、内质网肿胀较轻。视网膜内层平均厚度轻度变薄,与生理盐水对照组相比有显著性差异 (P ＜0.01)。 结论：金丝桃素作为一种特异性的蛋白激酶C抑制剂，对慢性高眼压下兔视网膜神经节细胞有保护作用。
【关键词】 金丝桃素 慢性高眼压 视网膜神经节细胞 神经保护 兔
The histology observation on the protective effect of hypericin on retinal ganglion cell in chronic ocular hypertension rabbits
Abstract AIM: To explore the effect of hypericin on retinal ganglion cell in chronic ocular hypertension rabbits. METHODS: Twenty rabbits were used to build chronic ocular hypertension model by posterior chamber injection of alpha-chymotrypsin. Ten days after successful model creation, hypericin 0.1mL or saline 0.1mL was injected into the vitreous cavity once a week for 2 weeks. Retinal ganglion cell of these eyes and that of four normal rabbit eyes were observed by light microscopy and electron microscopy. The thinckness of inner retina layer was examined.RESULTS: The number of retinal ganglion cell in saline-treated group decreased significantly. There was serious cell degradation with perinuclear condensation of chromatin and swelling organelles, but the change was slight in hypericin-treated group. The difference of the thickness of inner retina layer between the two groups was significant (P＜0.01).CONCLUSION: Intravitreal injection of hypericin as a protein kinase C antagonist can protect the retinal ganglion cell in chronic ocular hypertension rabbits.
· KEYWORDS: hypericin; chronic ocular hypertension; retina ganglion cell; nerve protection; rabbits
0引言
青光眼是一组与眼压升高有关的致盲性眼病。它的病理基础是视网膜神经节细胞进行性死亡。目前青光眼的治疗主要是降眼压，但是单纯降眼压并不能阻止视功能的继续下降。随着视神经保护理论的提出和研究，视神经保护治疗越来越受到人们广泛的关注[1]。我们就是基于视神经保护治疗的理论，探讨一种蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）抑制剂——金丝桃素对视网膜神经节细胞的保护作用。
1材料和方法
1.1材料 健康成年家兔24只，体质量2.0~2.5kg，无眼疾，雌雄兼用，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。金丝桃素和二甲基亚砜(sigma公司)、注射用糜蛋白酶（上海第一生化药业有限公司）、LZL-12型手术显微镜（镇江中天光学仪器有限责任公司）、Tonopen笔式眼压计（Medtronic Solan公司）。
1.2方法 健康成年家兔24只，随机挑选20只作为实验组，另4只作为对照组。实验组用200g/L乌拉坦5mL/kg，3min内注入耳缘静脉全身麻醉，每只兔随机选一眼作实验眼，的卡因点眼局部麻醉。用1mL注射器抽取400U 糜蛋白酶溶液0.2mL，从颞侧角巩膜缘进针，经瞳孔至对侧虹膜下注入后房，四环素眼膏涂眼。每日用Tonopen眼压计测眼压，眼压在30mmHg（1mmHg=0.133kPa）以上为慢性高眼压造模成功[2]。待高眼压模型眼压稳定升高10d后，随机挑选半数的高眼压兔作玻璃体内金丝桃素注射。金丝桃素用二甲基亚砜溶解，生理盐水稀释，终浓度为2μmol/L, 避光保存。实验兔乌拉坦全身麻醉加的卡因局部麻醉，在显微镜下用2mL注射器，从12点钟角膜缘后3mm处睫状体平坦部进针，抽出玻璃体0.1mL，注入金丝桃素0.1mL。1次/wk，连续2wk。另一半高眼压兔同上法操作，玻璃体内注入生理盐水0.1mL。1次/wk，连续2wk。正常兔4只，不做任何眼部和全身的处理，处死后进行下一步实验。第2次玻璃体注射后7d处死兔子，摘除眼球置于冰盒内，迅速去除眼前段，暴露并分离视网膜分别制作光镜电镜标本。光镜标本经40g/L福尔马林固定，乙醇梯度脱水，石蜡包埋切片，HE染色，光镜观察并照相[3]。电镜标本经30g/L的戊二醛和10g/L的锇酸固定，乙醇丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸双氧铀柠檬酸铅染色，电镜观察并照相[4]。观察所有家兔视网膜光镜下结构的变化并利用定量病的网格系统[5]，按J=LP．∑Pb/∑IA+∑Ib，视网膜内界膜至外核层内侧间的距离，以5次平均值(MTIRL)作为视网膜内层平均厚度[6]。
统计学处理:应用SPSS 11.0统计软件进行统计学处理,结果用 表示
2结果
我们采用后房注射α－糜蛋白酶的方法制备兔慢性高眼压模型。此方法高眼压发生快、持续时间长、眼压稳定。采用20只兔作为实验组造模，最终16只成功，其中一只因麻醉过量死亡，3眼压未达到预期水平，成功率为80%。造模后眼压一般在术后1wk内升高，实验眼呈牛眼状外观，眼球变硬,睫状充血,角膜水肿，前房加深，瞳孔散大。Tonopen笔式眼压计测得平均眼压为(34.12±2.31) mmHg,高眼压状态至少可维持2mo。
2.1光镜观察 光镜下见正常兔的视网膜组织结构清晰、完整，可观察到10层结构，外核层细胞数量最多，内核层细胞数量较少，节细胞为单层，形态呈类圆形（图1A）。生理盐水对照组视网膜内层变薄，神经节细胞数量明显减少，细胞出现变性，内、外核层细胞排列稀疏，数量减少（图1B）。金丝桃素治疗组损伤明显轻于生理盐水对照组，神经节细胞数量有所减少,胞核大部分存在，部分出现空泡样变，内核层和外核层结构与正常组所见相似（图1 C）。
2.2电镜观察 透射电镜下见正常视网膜神经节细胞核呈类圆形，染色质颜色清晰，分布均匀，内质网、线粒体等细胞器形态正常，细胞膜完整(图2A) 。生理盐水对照组神经节细胞明显减少，部分细胞严重变性，核结构稀疏，核仁固缩及偏位，胞质染色质边集，内质网肿胀，线粒体肿胀，嵴消失，空泡变性（图2B）。金丝桃素治疗组见部分核稍有变形，核染色质略显稀疏,颜色稍淡,线粒体空泡变性,残存线粒体嵴, 内质网仅见轻度肿胀（图2C）。视网膜内层平均厚度正常组为78.62±1.87μm, 金丝桃素治疗组为73.80±5.61μm, 生理盐水对照组为59.30±2.17μm。后两者相比有显著性差异(P＜0.01)。
图 1 兔视网膜神经节细胞 (HE×200) A：空白对照组正常；B:生理盐水对照组数量明显减少，出现变性；C：金丝桃素组数量减少,胞核大部分存在
图 2 兔视网膜神经节细胞超微结构(TEM×106) A：空白对照组核居中,细胞器形态正常,细胞膜完整；B：生理盐水对照组核仁固缩，胞质染色质边集，线粒体、内质网等细胞器肿胀；C：金丝桃素治疗组核染色质浓集,线粒体空泡变性,残存线粒体嵴
3 讨论
在临床上作为一种抗病毒药、抗抑郁药应用的金丝桃素是一种PKC的特异性抑制剂，是从金丝桃家族中提取的一种紫色结晶颜料[7]。目前已经有研究表明，金丝桃素对增生性玻璃体视网膜病变也有治疗作用[8]。通过本实验我们观察到，应用金丝桃素玻璃体内注射，视网膜神经节细胞的形态结构相比生理盐水对照组损伤明显减轻，视网膜内层平均厚度也比生理盐水对照组厚。这说明金丝桃素可以直接增强节细胞对抗有害因素的能力，促进受损细胞的存活和功能恢复。
青光眼的主要危险因素之一是病理性眼压升高。慢性高眼压对视网膜神经节细胞损伤的机制主要是因为眼压升高迫使筛板组织变形，使得节细胞轴浆流受阻于筛板，由此引起逆行运向神经节细胞胞体的神经营养性因子减少，神经节细胞释放谷氨酸，细胞外间隙谷氨酸蓄积，节细胞发生凋亡[9-12]。本实验中生理盐水对照组节细胞数量明显减少,部分严重变性, 核仁固缩，胞质染色质边集，线粒体、内质网等细胞器肿胀就是细胞凋亡的早期表现。PKC是一类钙、磷脂依赖性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，它可以通过一系列信号级联反应对谷氨酸受体和谷氨酸转运蛋白进行具有浓度和剂量依赖性的调节，使得细胞外间隙谷氨酸蓄积的同时，增强谷氨酸与其受体的作用，最终增加受体介导的兴奋毒性，导致视网膜神经节细胞的凋亡[13,14]。反之，PKC抑制剂则可拮抗这一作用。我们已经用实验证实了慢性高眼压兔不同时间点的视网膜谷氨酸含量都比正常值有所升高，而PKC抑制剂金丝桃素能拮抗这一作用。金丝桃素对视网膜神经节细胞组织学的保护作用，很可能是通过PKC抑制剂对视网膜谷氨酸含量的抑制这一机制来实现的。当然对于青光眼这种慢性疾病来说，反复玻璃体内注射，也是有其明显的不良后果的。因此，探讨金丝桃素的作用和调控机制，研究如何发挥其对青光眼视神经保护的治疗潜力，有待于我们今后进一步研究。
【】
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