TNF与糖尿病视网膜病变
【摘要】 系统性微血管病变和糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DRP）是糖尿病患者致死性及致盲性的根源，然而其具体机制尚不十分清楚。推测免疫和炎症反应可能涉及其病程及病理进展，尤其对于增殖性视网膜病变（perliferative diabetic retinopathy,PDR），因而有人提出DRP是一种炎症性疾病。本文就炎症反应最具代表性的细胞因子之一——肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）及其在糖尿病视网膜病变中的可能作用加以综述。
【关键词】 糖尿病视网膜病变 肿瘤坏死因子
Tumor necrosis factor and diabetic retinopathy
AbstractSystemic microvascular disease and diabetic retinopathy (DRP) are currently the principal causes of morbidity and mortality in patients with diabetes mellitus, yet the mechanism behind it has not been fully understood. It has been demonstrated that immune phenomena and inflammatory reactions might be involved in the pathogenesis and progression, especially in proliferative DRP. Therefore it has been indicating that DRP is an inflammatory disease. The present paper reviews one of the most representative cell factors, tumor necrosis factor (TNF) and its functions in DRP.
· KEYWORDS: diabetic retinopathy; tumor necrosis factor
0引言
糖尿病视网膜病变发病机制复杂，目前从糖尿病动物模型上对其发病机制在代谢方面、神经元及神经胶质细胞、血液流变学和血管生长因子方面均有所研究。现有观点认为[1]，糖尿病视网膜病变机制中包括了慢性长程炎症反应，炎症与免疫反应贯穿糖尿病视网膜病变的全过程。有人提出DRP是一种炎症性疾病[2]。肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）就是炎症反应中最具代表性的细胞因子之一。
1概述
细胞因子（cytokines, CK）是指由多种细胞，特别是免疫细胞产生的一类具有多种生物学活性的小分子多肽或糖蛋白，是细胞间相互交流的多肽，是各种炎症和自身免疫性疾病病理过程中的异常产物[3]。Doganay 等[4]认为TNF-α、白细胞介素（interleukin，IL）-1β、可溶性白细胞介素2受体（soluble interleukin-2 receptor，sIL-2R）、IL-6、IL-8等潜在性炎症性细胞因子可能共同作用于糖尿病视网膜病变的病程，使之进展。
TNF是Garswell等在1975年发现的一种细胞因子，他们将卡介苗注射给荷瘤小鼠，2wk后再注射脂多糖，结果发现在小鼠血清中存在一种能使肿瘤细胞发生出血坏死的物质，将其称之为肿瘤坏死因子。
2 TNF分类
根据来源和结构，可将TNF分为TNF-α和TNF-β两种：前者（TNF-α）主要由脂多糖或卡介苗活化的单核/巨噬细胞产生，亦称恶液质素，但实验发现许多组织具有合成，分泌TNF-α的潜能，包括脂肪组织、肌间组织等；后者（TNF-β）主要由抗原或有丝分裂原激活的T细胞和杀伤细胞（natural killer cell,NK）产生，又称淋巴毒素。TNF-α和TNF-β生物学活性基本相同，它们除具杀瘤作用外，还有抗感染、免疫调节和致炎作用。
3 TNF在糖尿病患者及糖尿病模型中含量的变化
3.1血清水平 Tanaka等[5]报导非胰岛素依赖型大鼠模型血清中TNF-α活性呈慢性上升。Doganay等[4]测得的PDR患者血清中TNF-α水平显著高于背景期糖尿病视网膜病变、尚未出现视网膜病变的糖尿病患者和正常对照者，并认为血清高水平表达TNF-α表示糖尿病视网膜病变患者免疫系统亢进，可能是疾病进程中的病理生理表现，国内还有许多研究资料表明，有糖尿病早期并发症者（如糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病）其TNF-α等细胞因子的血浆浓度均显著高于正常组；随着DM病理进展，免疫功能紊乱程度加重及并发症的出现，TNF-α等细胞因子的血浆浓度逐渐增高。
3.2眼内表达 由于人体的特殊性，人眼内TNF-α含量的观察对象一般是增殖性糖尿病视网膜病变患者。通过检测PDR患者眼内玻璃体中TNF-α水平的变化，来研究TNF与糖尿病视网膜病变由背景期向增殖期转变的相关性。
4 TNF的来源
4.1单核-巨噬细胞系统及淋巴细胞 TNF是具有广泛生物活性的多肽细胞因子，包括TNF-α和TNF-β两种。前者主要由单核巨噬细胞系统产生的蛋白质细胞因子，是重要的免疫调节因子；后者则来源于T、B淋巴细胞及NK细胞，与免疫调节和免疫炎症有关。
4.2小胶质细胞 作为中枢神经系统的一部分，神经视网膜是一种活跃的细胞集群，不断接受信息、分析信息、感知信息、并作出决定，最终导致视觉的产生。视网膜内九层主要由排列有序的神经元及围绕其周围的胶质细胞组成。视网膜神经胶质细胞又分为大胶质细胞（星形胶质细胞，Müller细胞）和小胶质细胞，小胶质细胞在结构、特性和细胞谱系等方面有其特殊性，属于神经系统游走巨噬细胞中单独的一群，其功能相当活跃。Webster认为[6]，无论是在疾病条件下还是在培养体系中，是小胶质细胞而不是星形胶质细胞作为关键的炎症前因子如TNF-α、IL-1，和免疫调节性细胞因子如IL-12、IL-18的主要来源。
小胶质细胞在损伤反应早期即被激活，它的激活是神经系统防御、感染、炎症、创伤、缺血和神经变性病的关键因素。中枢神经系统炎症发生时[7]，小胶质细胞接受损伤信号刺激后，立即向损伤部位迁移，部分小胶质细胞贴近损伤的神经细胞，此时细胞处在介于静止和激活之间的一种中间状态，它们会很快增殖、消化和降解微生物、死亡的细胞及其它组织碎片、促进组织修复。小胶质细胞能附着于受伤神经元表面，若神经元受到轻微损害或者受损后仍能恢复正常，小胶质细胞就不会向吞噬型转变；但当损伤严重，神经元濒临死亡，它就会转变为巨噬细胞并行使其吞噬功能。
小胶质细胞是目前已知的唯一的视网膜抗原递呈细胞，在正常视网膜中，小胶质细胞一般处于静止状态，但易被微小的病理变化所激活，激活状态的小胶质细胞可表达大量与炎症及吞噬作用密切相关的受体和因子，并吞噬受损神经元、胶质细胞碎片及外来抗原，对机体产生有益的保护作用；但在特定条件下也可通过免疫增强导致神经系统的病理的损伤[8]，产生一些潜在的神经毒素如TNF-α、IL-1β、干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)等，从而致神经元死亡。
糖尿病视网膜病变时，小胶质细胞处于激活状态，在早期数量即增加，参与了发病过程[9，10]。病程早期，位于神经节细胞层和内丛状层的小胶质细胞激活并释放细胞因子如TNF-α、IL-1β，而这些因子可加重血-视网膜屏障的破坏[11]。
小胶质细胞作为视网膜固有免疫细胞，在诱导炎症方面和感染代谢压力方面始终处于重要地位。
4.3视网膜周细胞 视网膜毛细血管主要由周细胞和内皮细胞组成，周细胞和内皮细胞的功能完整对维持视网膜毛细血管的稳定性具有十分重要的作用，视网膜毛细血管周细胞与大血管平滑肌相似，位于毛细血管外周，被内皮细胞基膜包绕。
视网膜微血管周细胞的选择性丧失是糖尿病微血管病变的最早期的病理改变之一。周细胞的死亡不仅破坏了毛细血管的完整性，还可以使内皮细胞的增生失去控制。早期DRP中，周细胞选择性丧失，血管直径和通透性增加，由于周细胞含有与血管平滑肌细胞相似的收缩成分，故周细胞对血管活性调节因子的反应可能与早期糖尿病视网膜病变有关[12]。
实验研究表明[13]，在高糖作用下，色素上皮细胞、巨噬细胞及胶质细胞增殖明显，而周细胞条件培养液能抑制上述细胞的增殖活性，且随浓度增加，抑制作用亦越显著，提示在糖尿病视网膜病变时周细胞的缺失将导致色素细胞、巨噬细胞及胶质细胞的增殖。Romeo等[14]认为，周细胞在糖尿病诱发下也会释放炎症前因子，如TNF-α，IL-1β。
4.4血小板和巨核细胞 胰岛素依赖性糖尿病微血管病变并发症与血小板异常有很强的联系，增殖期糖尿病视网膜病变是胰岛素依赖性糖尿病的一个常见的并发症，以视网膜新生血管和玻璃体视网膜介面新生血管膜形成为特征。PDR早期组织病特征是微血管阻塞和视网膜缺血，此时血小板粘附和积聚起到重要作用。基于这些，Limb等[15]调查胰岛素依赖性糖尿病微血管病变患者并发PDR、不并发PDR及正常人中血小板表达这些分子的情况，观察到胰岛素依赖性糖尿病患者合并活跃PDR的体内被TNF-α着色的血小板数量较无微血管并发症者(静止性PDR或健康人)显著增多。同时，有活跃性PDR的患者其血小板表达TNF-RI（tumor necrosis factor-receptorI，肿瘤坏死因子受体I）及TNF-RII（tumor necrosis factor-receptorII，肿瘤坏死因子受体II）的比例较正常对照或静止性PDR患者高。血小板表达的TNF-α和TNF-R之间在PDR患者中有直接关联，表明TNF-α标记的血小板可能将TNF-α绑定到其受体上。研究已证实[16,17]血小板制造出细胞因子，这些细胞因子导致细胞溢出，新生血管形成和纤维化。血小板及与之相连的TNF-α通过TNF-α的介导可增加纤维血管和纤维细胞的功能，可能导致了IDDM、微血管并发症的发生。另外，人巨核细胞样细胞株HV3也可表达TNF-α，IL-1β，IL-6等细胞因子[16]。
5 TNF-α的作用及其在糖尿病视网膜病变中的作用机制
TNF-α是一种具有广泛生物学活性的细胞因子，参与机体多种反应，具有极强的生物学效应。这种细胞多肽调节因子以自分泌、旁分泌和外分泌的方式作用于靶细胞、靶器官，与相应的特异性受体结合，产生特有的生物学效应，细胞因子与相应受体结合能力很高，极微量即可产生明显的生物学效应，而TNF-α分泌水平的变化与糖尿病视网膜病变密切相关。
5.1血-视网膜屏障(blood retinal barrier,BRB)受损 在高血糖的环境下，代谢发生异常，破坏了视网膜毛细血管的结构和功能，造成视网膜的损害，使视网膜处于缺血缺氧状态。这种缺氧刺激打破了视网膜血管生长因子和抑制因子间的平衡，促使血管生成因子TNF-α增加，TNF-α广泛分布于DRP血管内皮细胞表面，通过打开视网膜血管内皮细胞和色素上皮细胞的紧密连结而致BRB破坏[17-19]。BRB的破坏伴随进行性血管渗透性增加是使DRP从非增殖性状态向形成视网膜新生血管转变的重要因素。BRB破坏后，玻璃体中细胞因子水平增高，也因此导致DRP病变的进展。
5.2引起视网膜血管病变 TNF-α含量增加可导致视网膜血管通透性增高，刺激血管外基质过量产生和血管内皮细胞的增殖，导致眼内新生血管形成；血管通透性增高，使血清蛋白持续向血管外渗漏，导致玻璃体血清蛋白含量增高[20]。TNF-α存在于PDR患者纤维血管膜浸润细胞、视网膜血管内皮细胞及细胞外基质中，提示其在PDR新生血管形成过程中起重要作用[21]。全身以及视网膜血管血流受累，最终导致异常血管渗漏。现已阐明[4]视网膜血流增加和进展性非增殖性视网膜病变伴随静脉扩张导致视网膜血管不能自我修复，通过激活促凝血酶原，抑制抗凝蛋白C旁路及合成纤溶激活剂抑制物等作用，刺激血小板和内皮细胞释放血小板源生长因子样有丝分裂原，甚至血小板源生长因子，这些效应最终会刺激血管外基质过量产生和血管内皮细胞的增殖，导致眼内新生血管形成，促进PDR的发生[22]。
5.3直接杀伤细胞 TNF通过与TNF-R连接后，促发凋亡作用，诱导神经元死亡及通过生长因子如胰岛素生长因子-1（Insulin-like Growth Factor-1,IGF-1）和胰岛素受体直接侵入细胞内底物[23]。
5.4诱发炎症反应 TNF-α属炎症前细胞因子。炎症起始阶段，在促炎细胞因子TNF-α、IL-1、IL-6和其他炎性介质如C3a/C4a/C5a作用下，血管内皮细胞表达E-选择素和膜型IL-8等与粘附有关的膜分子。TNF等可改变血管粘附分子的表达，从而使淋巴细胞和巨噬细胞到达靶部位。而现在的研究表明[23]，糖尿病视网膜病变机制中包括了慢性长程炎症反应。增多的细胞因子使小胶质细胞活化，从而刺激炎症循环而使白细胞增加，以致血管破坏，直接通过释放细胞毒性物质诱导细胞死亡。
5.5作用于血小板 TNF-α可诱导血小板释放血管活性分子[24]，促使其粘附于血管内皮[25]，并表达细胞间粘附分子1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)，可刺激血小板和内皮细胞释放血小板活性生长因子样有丝分裂原，甚至血小板源性生长因子。已有报道[15]，PDR患者的血清中TNF-α含量在血小板表达增加。并认为，胰岛素依赖型患者血小板表达TNF-α、TNF-R及ICAM-1水平升高可以作为糖尿病微血管并发症病程中血小板(血凝细胞)异常的重要标志。
5.6激活小胶质细胞 有许多证据表明细胞因子在对小胶质细胞的活化中起作用，细胞因子如TNF、IL-1B、IL-6等都有直接激活小胶质细胞的作用。TNF可降低小胶质细胞中cAMP水平，诱发出更具破坏性的显型。而激活的小胶质细胞释放可溶性受体，这些受体可直接或间接引起神经元细胞的损害；同时也释放细胞因子[23]。糖尿病视网膜病变时，活化的小胶质细胞可能参与了血-视网膜屏障的破坏[11]。小胶质细胞也作为抗原呈递细胞在视网膜和邻近组织的炎症反应中发挥作用[10]。
5.7诱导细胞调亡 细胞凋亡通路包括死亡受体介导的凋亡信号途径以及细胞内在的线粒体凋亡信号途径。在一定条件下，TNF-α通过与其受体结合，激活死亡受体通路而诱导细胞凋亡 [26,27] 。正常状态下，TNF-α在激活凋亡通路的同时又激活肿瘤坏死相关因子2-NF-κB介导的抗凋亡通路。在死亡受体介导的凋亡信号通路中，首先是死亡配体与相应的死亡受体结合，引起胞液中含死亡结构域结合位点的Caspase 8酶原募集，进而被裂解成为有活性的Caspase 8，激活Caspase 3，6，7，活化的Caspase 3，6，7裂解相应底物而导致细胞凋亡。其中，PARP是活化Caspase 3的底物，在此凋亡信号通路中，Caspase 8裂解活化是必须的环节，Caspase 8裂解活化及PARP的降解表示凋亡信号通路的激活及细胞凋亡。
TNF-α诱导细胞凋亡需要NF-κB被抑制[28~30]。NF-κB是由Rel蛋白家族P50、P52、P65（RelA）、RelB、c-Rel中任意两种蛋白组成的同源或异源异二聚体，NF-κB的活性由其抑制蛋白iκB家族控制，iκB家族包括iκBα、iκBβ、iκBε3种分子。生理情况下，核转录因子NF-κB与抑制蛋白iκBα结合成异二聚体存在于细胞浆而无活性；当细胞受到刺激，如TNF-α的作用，通过一系列信号作用，iκBα磷酸化、构型改变并降解，NF-κB从NF-vB-iκBα复合物中释放并转移至细胞核从而活化[29-32]。
5.8其他 TNF-α还能引起细胞分裂及成纤维细胞的增殖，刺激胶原的产生，提高靶细胞对其它生长因子的反应性；低浓度的TNF-α是视网膜色素上皮培养中最有力的有丝分裂原之一；在色素上皮细胞的生长、分化过程中起重要作用。Doganay S等 [4]认为，血清TNF-α水平与DRP等级相关，但无法区分究竟其增加是DRP病变过程的原因还是结果。
6展望
TNF是一种具有广泛生物学活性的细胞因子，它的作用越广泛，参与反应的机制就越复杂。TNF在糖尿病视网膜病变中的作用机制仍需进一步的研究，但其作为炎症前因子所导致的视网膜血管、屏障受损机制，为如何糖尿病视网膜病变提供了新的思路。
【】
1 Abu El-Asrar AM, Desmet S, Meersschaert A, Dralands L, Missotten L, Geboes K. Expression of the inducible isoform of nitric oxide synthase in the retinas of human subjects with diabetes mellitus. Am J Ophthalmol ,2001;132(4):551-556
2 Adamis AP. Is diabetic retinopathy an inflammatory disease? Br J Ophthalmol , 2002;86(4):363-365
3 Balkwill FR, Burke F. The cytokine network. Immunol Today ,1989;10:299-304
4 Doganay S, Evereklioglu C, Er H, Turkoz Y, Sevinc A, Mehmet N, Savli H. Comparison of serum NO, TNF-α, IL-1β, sIL-2R、IL-6 and IL-8 levels with grades of retinopathy in patients with diabetes mellitus. Eye ,2002; 16:163-170
5 Tanaka S, Seino H, Satoh J, Fujii N, Rikiishi H, Zhu XP, Takahashi K, Sagara M, Nobunaga T, Toyota T. Increased in vivo production of tumer necrosis factor after development of diabetes in nontreated, long-term diabetic BB rats. Clin lmmunol lmmunopathol ,1992;62:258-263
6 Webster SD, Park M, Fonseca MI, Tenner AJ.Structural and functional evidence for microglial expression of C1qR(P), the C1q receptor that enhances phagocytosis. J leukoc Biol ,2000;67(1):109-116
7 Chen A, Kumar SM, Sahley CL, Muller KJ. Nitric oxide influences injury-induced microglial migration and accumulation in the leech CNS. J Neurosci ,2000;20:1036-1043
8 Wierzba-Bobrowicz T, Schmidt-Sidor B, Gwiazda E, Lechowicz W, Kosno-Kruszewska E. Major histocompatibility complex class Ⅱ expression in the frontal and temporal lobes in the human fetus during development. Folia Neuropathol ,2000;38:73-77
9 Rungger-Brandle E, Dosso AA, Leuenberger PM. Glial reactivity, an early feature of diabetic retinopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci ,2000;41:1971-1980
10 Zeng XX, Ng YK, Ling EA. Neuronal and microglial response in the retina of streptozotocin-induced diabetic rats. Vis Neurosci , 2000;17:463-471
11 Rao NA, Kimoto T, zamir E. Pathogenic role of retinal microglia in experimental uveoretinitis. Invest Ophthalmol Vis Sci ,2003;44:22-31
12陈百华,姜德咏.周细胞与糖尿病视网膜病变.眼科新进展,2002;22(2):133-135
13韩冰,徐强,朱荃,韩凌.周细胞条件培养液对视网膜色素上皮细胞、胶质细胞及巨噬细胞增殖的影响.国际眼科杂志,2004;4(5):829-830
14 Romeo G, Liu WH, Asnaghi V, Kern TS, Lorenzi M. Activation of nuclear factor-kappaB induced by diabetes and high glucose regulates a proapoptotic program in retinal pericytes. Diabetes ,2002;51:2241-2248
15 Limb GA, Webster L, Soomro H, Janikoun S, Shilling J.Platelet expression of tumour necrosis factor-alpha (TNF-alpha), TNF receptors and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) in patients with proliferative diabetic retinopathy. Clin Exp lmmunol ,1999;118:213-218
16 Soslau G, Morgan DA, Jaffe JS, Brodsky I, Wang Y.Cytokine mRNA expression in human platelets and a megakaryocytic cell line and cytokine modulation of platelet function. Cytokine ,1997;9:405-411
17陈雨,朱晓华.糖尿病视网膜病变发病机制的研究进展.国际眼科杂志,2006;6(2):433-435
18朱鸿,施彩虹.糖尿病视网膜病变的相关诊断技术展望.国际眼科杂志,2005;5(5):1016-1019
19 Stack G, Snyder EL. Cytokine generation in stored platelet concentrates. Transfusion ,1994;34:20-25
20黄敬泽,王健,张闿珍,王依星.血管内皮细胞损伤在2型糖尿病血管病变中的意义.中华内分泌代谢杂志, 2000;3(2):169
21张士胜.肿瘤坏死因子与眼部疾病.国外医学眼分册,2001;25:176
22孙文涛,张小玲,高嵩.糖尿病性视网膜病变发生发展的相关因素.国际眼科杂志,2005;5(4):755-759
23 Krady JK, Basu A, Allen CM, Xu Y, LaNoue KF, Gardner TW, Levison SW. Minocycline Reduces proinflammatory cytokine Expression, Microglial Activation, and Caspase-3 Activation in a Rodent Model of diabetic retinopathy. Diabetes ,2005;54:1559-1565
24 Radomski MW, Vallance P, Whitley G, Foxwell N, Moncada S. Platelet adhesion to human vascular endothelium modulated by constitutive and cytokine induced nitric oxide. Oardiovasc Res ,1993;27:1380-1382
25 de Kossodo S, Moore R, Gschmeissner S, East N, Upton C, Balkwill FR.Changes in endogenous cytokines, adhesion molecules and platelets during cytokine-induced tumour necrosis. Br J Cancer ,1995;72:1165-1172
26 Yin XM. Bid, a critical mediator for apoptosis induced by the activation of Fas/TNF-R1 death receptors in hepatocytes. J Mol Med ,2000;78:203-211
27 Sartorius U, Schmitz I, Krammer PH. Molecular mechanisms of death-receptor-mediated apoptosis. Chembiochem ,2001;2:20-29
28 Natoli G, Costanzo A, Guido F, Moretti F, Bernardo A, Burgio VL, Agresti C, Levrero M. Nuclear factor kB-independent cytoprotective pathways originating at tumor necrosis factor receptor-associated factor 2. J Biol Chem ,1998;281:1680-1683
29 Karin M, Lin A. NF-kappaB at the crossroads of life and death. Nat Immunol ,2002;3:221-227
30 Wang CY, Mayo MW, Korneluk RG, Goeddel DV, Baldwin AS Jr. NF-kappaB antiapoptosis:induction of TRAF1 and TRAF2 and c-IAP1 and c-IAP2 to suppress caspase-8 activation. Science ,1998;281:1680-1683
31 Hehner SP, Heinrich M, Bork PM, Vogt M, Ratter F, Lehmann V, Schulze-Osthoff K, Droge W, Schmitz ML. Sesquiterpene lactones specifically inhibit activation of I kappa B-alpha and I kappa B-beta. J Biol Chem ,1998;273:1288-1297
32 Chen FE, Huang DB, Chen YQ, Ghosh G. Crystal structure of p50/p65 heterodimer of transcription factor NF-kappaB bound to DNA. Nature ,1998;391:410-413
