异位F1F0 ATP合酶及其与肿瘤血管生成的关系
【摘要】 异位F1F0 ATP合酶作为一个细胞表面受体，它可表达在血管内皮细胞表面黏合血管抑素(angiostatin，又称血管生成抑制素)，调节细胞表面ATP水平，进而影响血管内皮细胞的增殖和分化。血管抑素在低pH值时可以黏合并阻滞细胞表面的F1F0 ATP合酶，继而干扰其活动；籍此发挥强大的内皮细胞杀伤效应，在抑制肿瘤血管生成中起着重要作用。
【关键词】 内皮细胞
肿瘤的生长和转移依赖血管生成。关于血管生成抑制药物的筛选仍是当前热点。新研究的异位F1F0 ATP合酶作为一种内皮细胞表面血管源性受体已被识别。这种异位ATP合酶能催化ATP合成，在特定条件下可被血管抑素（angiostatin）抑制。当血管抑素发挥抑制作用时，内皮细胞会难以维持正常胞内pH值而死亡。
1 异位F1F0 ATP合酶概况
在线粒体内，通过在无机磷酸盐(Pi)和ADP之间制造一个高能化学联结带，ATP合酶可以将呼吸链产生的质子梯度能量转换为ATP。这个合酶复合物过去被认为是严格表达在线粒体内部，但近来很多报道认为：ATP合酶的构成部分也存在于细胞膜表面，它们可以作为多种配体的受体参与各种过程，如脂代谢调节、细胞增殖控制、细胞凋亡、内皮细胞分化以及肿瘤的免疫识别[1~3]。该复合物第一个区域是膜内F0区域（包含c10~c14环）。这个F0区域是一个旋转发动机，它能够使c10~c14环旋转；线粒体呼吸链所产生的质子电化学势能，驱动着这个旋转发动机[4]。ATP合成酶的第二个区域F1是起催化作用的，它由αβ二聚物合成的一种三聚物组成[5]。这两个区域分别被中心和外周的杆状单位所连接[6,7]。中心的杆状单位由γ、δ、ε亚单元构成，δ、ε两个亚单元将γ的一个末端耦合至c环上，这样c环可以和γ亚单元一起旋转[8,9]。丧失了F0区域的复合物，或者没有合酶活动的复合物通常被称为F1 ATP酶（F1）[10]。反之，一个完整的复合物被称为F1F0 ATP 合酶。
通过免疫荧光和显微镜技术，发现表达在细胞表面的线粒体蛋白[11]。有报道认为βF1亚单位作为一个细胞表面蛋白，它可以被非渗透性膜反应物生物素化，参与细胞毒素淋巴细胞的交互作用与某些催化作用[12]。而且，免疫荧光能测到F1的构成元件[13,14]。Kim等通过显微镜法、生化方法和细胞分级分离法，为F1在细胞表面的表达提供了有力的证据，并被扩展至成熟肝细胞、角化细胞和血管内皮细胞等。α、β亚单位也在许多肿瘤细胞株中被发现。就目前所知，虽然报道成熟细胞表达F1，但这种表达在组织切片中还没有被发现。可能的原因是：组织经固定后，抗原性F1F0的抗原决定簇变得不够稳定。
2 血管生成与血管生成抑制
肿瘤生长所需的新血管源于现有正常血管，过去我们称之为血管生成（Folkman,1971)。血管生成涉及到血管生成因子与血管生成抑制因子之间的调节失衡。受肿瘤所释放的可溶性血管生成因子影响，这些源于局部毛细血管、小动脉、小静脉的新生血管，会促使肿瘤超常规迅速成长。血管抑素作为一个天然血管生成抑制剂，已被证实可以抑制血管生成，并有效阻止肿瘤生长。Folkman提出了“血管生成开关”的概念，即存在一个信号平衡血管生成和血管稳定（angiostatic）；这个网络是基于一定数量的血管生成信号与血管稳定信号来运行的。
Folkman和O’Reilly等描述了以下现象，在某些肿瘤外科手术中，经常可以见到原发肿瘤去除后，转移灶肿瘤仍迅速生长。这一现象已被许多实验模型证实[15]。在这些模型中，原发肿瘤切除后，那些快速生长的转移瘤并不是起源于肿瘤细胞的播种，而是起源于早已存在的微小转移灶。“血管生发开关”在原发肿瘤处会倾向血管生成；而继发转移处“血管生发开关”会倾向血管稳定。肿瘤原发灶范围内，稳定因子也会产生，只是没有足够的数量来对抗血管生成。另外，血管稳定因子在循环中可能有更长的半衰期，所以在远离原发肿瘤部位的区域，“血管生发开关”的效应往往相反。原发部位的肿瘤切除后，这些血管稳定因子数量变得相对不足，从而使转移性肿瘤产生的前血管生成因子主导了“血管生发开关”，促进了远处肿瘤新生血管的生成。
3 细胞表面异位F1F0 ATP合酶
在内皮细胞表面，异位F1F0 ATP合酶作为一种受体已被确认存在。Moser等对内皮细胞表面血管抑素粘合位点的鉴定做了大量工作。和其他的纤溶酶原裂解物一样，如纤维蛋白溶酶，血管抑素也由此衍生而成。研究者分别准备了放射性碘标记的血管抑素与纤溶酶原，然后通过细胞黏合测定的方式，证明了血管抑素确实黏附于人类脐静脉上皮母细胞(HUVEC)表面的特殊位点，而且与纤溶酶原有着不同的粘连动力学。另外纤溶酶原和血管抑素并不相互竞争黏附于HUVEC，进一步验证了两者存在不同的粘合位点。
为了鉴定黏合位点，研究者们准备了一个与琼脂糖凝胶匹配的血管抑素亲和层析柱，另一个溶酶原亲和层析柱作为实验对照。培育好的HUVEC细胞表面用生物素来标记，以此来确认黏合蛋白对应的细胞表面特定区域。从HUVEC细胞抽提的质膜通过每一个层析柱，然后彻底冲洗掉那些未被黏合的物质。从每个层析柱上洗提黏合蛋白做SDS-PAGE和Westen blot定性分析，再根据所选择条带进行广泛的蛋白组学定性研究。HUVEC质膜通过后的纤溶酶原亲和层析柱，在SDS凝胶上产生了一条Mw~44kD的蛋白条带。这种蛋白被免疫测定证明是annexin Ⅱ。与之对应的血管抑素层析柱并没有产生对annexin Ⅱ抗体有反应的蛋白。相反，发现了一系列从20kD~65kD不等的蛋白条带，大多集中在Mw~55kD左右。蛋白条带从凝胶中提取后进行大样本的肽链图谱分析，从中发现这个条带包含了F1F0 ATP合酶的α和β亚单位。
F1F0 ATP合酶也是线粒体内膜的组成成分。Das最先在肿瘤细胞株A549的细胞表面探测到了F1F0 ATP合成酶的β亚单位；但是这种观察随后也遭到了质疑，有人认为：可能是遗传不稳定细胞株中异常的运输导致了这个结果。Soltys等进一步描述了在特定细胞膜表面所发现的线粒体基质蛋白的多样性。尽管人们提出了许多机制来解释线粒体基质蛋白移位到线粒体之外的区域，但是具体细节仍不清楚。为进一步研究细胞表面的F1F0 ATP合酶，Moser等试验了两种假说：首先，他们提出了对抗F1F0 ATP合酶的非抑制性抗体是否能够阻止血管抑素的粘合与活动；其次，又提出了对抗F1F0 ATP合成酶的抑制性抗体是否能够模拟血管抑素的功能效应。
4 血管生成调控与异位F1F0 ATP作用机制
通过大量实验，Yegutkin等[16]证实在HUVEC和淋巴细胞表面存在ATP合成与水解的相互抵消作用，而这种合成也包括了腺苷酸激酶（AK）与核苷酸氯喹激酶（NDPK）。淋巴细胞通过这些活动在其表面维持了一个稳态的ATP水平，而在内皮细胞中核苷酸酶的活动处于主导地位[17]。但这些并没有提供ATP合酶活动的直接证据[16]。两种天然的抗血管生成肽已被证实可以和内皮细胞表面的F1相互作用，一种是上述的血管抑素，另一种是内皮性单核细胞激发多肽Ⅱ(EMAPⅡ)。EMAPⅡ是由一些肿瘤细胞释放的炎性肽，可以激发趋化单核巨噬细胞和中性细胞。Chang 等已鉴定出F1的α亚单位是内皮细胞上EMAPⅡ的一个配体，在THP-1 和CEM细胞株上情形也类似。
目前认为，血管抑素在低pH值时会发挥强大的血管内皮细胞杀伤效应。当血管抑素在pH值6.5~7.5时，可以黏合并阻滞细胞表面的F1F0 ATP合酶。即使胞外pH值下降到与肿瘤类似的pH范围（6.5~6.7），血管内皮细胞仍可维持一个相对正常的胞内pH值。在胞外pH压力下，当血管抑素通过F1F0 ATP合酶作用于内皮细胞，会引起胞内pH值的迅速下降，继之血管内皮细胞死亡。血管抑素结合到细胞表面调节ATP水平，限制细胞的迁移和增殖，进而限制血管的分化生成。或许pH张力是血管抑素造成血管内皮细胞死亡的最根本调节器，血管抑素似乎也可通过F1F0 ATP合酶来调节质子流的阻抑。有人认为在K1-5诱导的血管生成抑制的凋亡通路中，异位F1F0 ATP合酶发挥着最为核心的作用[18]。
除了血管抑素，同样可以下调ATP合成的还有特殊的F1F0抑制剂，比如：抗α亚单位抗体、抗β亚单位抗体、寡霉素、efrapeptins或者白藜芦醇等[2,19]。此外，和单克隆抗α/βF1抗体类似的方式[1]，血管抑素下调HUVEC增殖。但是一个多克隆的抗α亚单位抗体产生的效应却与之相反，说明异位F1F0 ATP合酶参与调节了这个过程。新的研究热点IF1肽也在HUVEC细胞表面被检测到，但它的数量非常之少[2,20]。IF1在线粒体中可以抑制ATP水解。Burwick等利用孤立线粒体和内皮细胞进行研究，证实IF1尽管抑制了ATP水解，并使细胞表面ATP聚集，但它并没有抑制ATP的合成；并且IF1效应也受pH值影响[2]。或许，IF1是抗血管生成的一个潜在调控者。
5 结 语
异位F1F0 ATP合酶作为一个细胞表面受体已被证实存在。异位F1F0 ATP合酶可表达在血管内皮细胞上黏合血管抑素，进而影响血管内皮细胞的增殖和分化。尽管内皮细胞表面存在F1F0/F1合酶，但它真正的参与机制并没完全清楚。研究者正进一步探讨血管生成抑制与异位F1F0 ATP合酶作用的具体细节，以及相关的细胞表面ATP代谢和pH动态平衡情况[21]。
最近有学者指出F1F0 ATP合酶是热休克蛋白90（HSP90）的协同作用蛋白，而抑制HSP90蛋白的功能被认为是实体瘤和白血病的新颖途经[22]。另有学者提出：借助于异位F1F0 ATP合酶的作用，血管抑素在低胞外pH的条件下可以直接对肿瘤细胞发挥细胞毒性作用[23]。这些观点为异位F1F0 ATP合酶在肿瘤发生和进展中的机制增添了新的含义，也为下一步靶向治疗的研究指明了方向。
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