持续低剂量率照射对血管损伤的研究进展
【摘要】 全文从持续低剂量率放疗的物特点、生物学特点以及对血管的损伤等方面对其生物学效应作了初步阐述。与传统的外照射相比近距离照射具有局部剂量高，达到边缘后剂量突然下降；照射范围内剂量分布不均匀，近源处最高；照射时间短，采取一次连续照射或数次照射完成等特点。持续降低照射剂量率，许多细胞系中细胞的死亡率并不是随剂量率的降低平行下降。而是当剂量率下降到某一个临界值时，继续降低剂量率，细胞的死亡率反而明显的增加，产生所谓的“反剂量率效应（inverse dose rate effect ）”。持续低剂量率照射对血管的损伤是照射区域炎症反应；血管内皮细胞以及血管平滑肌细胞增殖抑制、凋亡增加综合作用的结果。
【关键词】 血管损伤
近距离放疗应用于临床治疗虽已有100多年的，但应用之初由于对其放射生物学效应知之甚少，加之防护困难、有限的治疗效果和较重的组织损伤，使这种治疗方法在之后很长的一段时间内处于停滞的状态。20世纪80年代，新型的放射性核素125I和103Pa进入临床。由于这两种核素与以往所使用的226Ra、222Rn以及192Ir相比具有低剂量率以及低能、射程短等独特的物理学优势，临床上防护简单；利用机三维治疗计划系统制定治疗计划，在影像系统的引导下布源，从而使得靶区剂量分布均匀，周围正常组织损伤很小；与以往常规放疗相比在比较短的时间内就能完成整个治疗计划。目前，在临床上某些肿瘤如前列腺癌等的治疗中取得了很好的治疗效果，显示了广阔的应用前景[1]。
1 持续低剂量率放疗的物理学特点
“近距离治疗”（brachytherapy）一词来源于希腊文brachy，是“近”的意思。它与希腊文tele“远”一词相对。与传统的外照射相比近距离照射具有局部剂量高，达到边缘后剂量突然下降；照射范围内剂量分布不均匀，近源处最高；照射时间短；采取一次连续照射或数次照射完成治疗这些特点。近距离治疗的模式根据点剂量率的不同划分为以下几个区段和类别：低剂量率(low dose rate，LDR<2Gy/h～4Gy/h）；中剂量率（middle dose rate，MDR，4Gy/h～12Gy/h）；高剂量率（high dose rate，HDR，>12Gy/h）；脉冲剂量率（pulse dose rate，PDR，指剂量率在1Gy/h～3Gy/h，照射间隔1次/h，每次治疗10min左右的模式）[1，2]。
2 持续低剂量率放疗的生物学特点
临床上之所以将近距离治疗的模式根据参考点剂量率的不同划分为几个区段和类别是因为在不同的剂量率下对应的生物效应各不相同。
HDR是指剂量率>12Gy/h，即剂量率高到足以在很短时间内（短于亚致死性损伤的修复，即<1h）完成照射，从而使在1min或5min内所实施的照射剂量效应差别不大，当照射时间长于15min～20min时生物效应下降。而LDR具有三个主要特点：①照射的实施是在肿瘤内或肿瘤附近，因此通常可以达到理想的剂量分布；②它是在一段时间以内持续进行照射，因此在治疗期间可发生亚致死性损伤的修复；③通常在较短的时间内完成治疗，总治疗时间大大短于外照射[3]。
2.1 持续低剂量率放疗时的剂量率效应
通常所说的剂量率效应是指：实施放射治疗时，每单位剂量生物效应随剂量率降低而下降，这是由于在较长的照射期间发生了亚致死损伤的修复。当剂量率>2Gy/min时，在多数真核细胞系统中有生物学意义的照射剂量将在数分钟内完成，在照射过程中极少发生或不发生DNA单链断裂的修复，也观察不到剂量率效应。当剂量率<2×10-3Gy/min时，在多数真核细胞系统中有生物学意义的照射剂量将在数小时内才能完成，DNA单链的修复大致是完全的。当剂量率低于2Gy/min高于2×10-3Gy/min时，有生物学意义的照射剂量的给出时间和DNA单链断裂的修复速率常数差不多，可以观察到剂量率效应，表现为剂量率变化时生物效应关系也随之变化。这种变化可以用“4R”来描述，所谓“4R”是指：①亚致死损伤的修复（repair of sublethal damage）：细胞受照射发生亚致死损伤的修复，它的速率一般为30min到数小时当剂量率从1Gy/min下降到0.1Gy/min时，修复将会修饰放射效应。在LDR治疗时，由于总治疗时间的关系，亚致死性损伤的修复是最重要的因素。②周期内细胞的再分布（redistribution within the cell cycle）：快增殖组织在几天内发生周期细胞的再分布，再分布的影响相对次要。再分布可能只与用相对长的半衰期的放射性核素（如125I半衰期59.6天）的植入有关。③再群体化（repopulation）：再群体化是一个很慢的过程，人体肿瘤或正常组织的再群体化不会低于一天，可能是几天到几周。当剂量率在很低的范围（低于2cGy/min），照射时间将持续几周时，单次照射会发生有意义的再群体化从而影响放射效应。④乏氧细胞的再氧合（reoxygenation）：它对于肿瘤细胞而言是一个很重要的生物学因素。再氧合在LDR比HDR更有效，特别是那些只进行近距离治疗的病人，这是由于LDR与HDR相比，用LDR乏氧细胞所受的损伤大于分次HDR治疗；而用HDR氧合的肿瘤细胞所受的损伤大于氧合的正常细胞[1，2]。
2.2 持续低剂量率放疗时的反剂量率效应
在LDR放射治疗中，每单位剂量生物效应随剂量率降低而下降，但临床经验和大量的研究都显示，持续降低照射剂量率，许多细胞系中细胞的死亡率并不是随剂量率的降低平行下降。而是当剂量率下降到某一个临界值时，继续降低剂量率，细胞的死亡率反而明显增加，产生所谓的“反剂量率效应”（inverse dose rate effect ）。Mitchell CR等[4]报道，当给予一个低于30cGy/h的持续低剂量率照射时可以观察到明显的反剂量率效应，他以T98G人类胶质细胞作为研究材料进一步研究了当给予一个LDR预照射是否会消除通常观察到的反剂量率效应。结果是当给予一个30cGy/h～60cGy/h，总量5Gy（使用60Co）的预照射后，马上用240-KVpX-射线给予持续低剂量率照射时反剂量率效应没有出现，但间隔4h后重新出现；当给予5cGy/h～10cGy/h，总量2Gy的预照射时，反剂量率效应不受影响。当预照射总量从5Gy逐渐下降到2Gy时，反剂量率效应也在逐渐增强。关于反剂量率效应的产生，目前有如下几种假说：①“G2期阻滞”，有些细胞系如Hela细胞系，在1.54Gy/h的照射后，细胞被阻滞在周期的不同时相而停止分裂。当剂量率降至0.37Gy/h时，细胞在周期内前进并被阻滞于辐射敏感的G2期，因此在持续低剂量率照射时，一个本来非同步化的细胞群体变成了一个G2的细胞群体[5]。但Mitchell CR等[6]观察以前已被证实对低剂量敏感的前列腺癌细胞PC-3，胶质母细胞瘤T98G和AT细胞系，用60Co-γ线照射，发现在剂量率0.02Gy/h～1Gy/h表现出反剂量率效应，分析细胞周期，未发现反剂量率效应与G2/M期积累或其他周期阻滞呈相关性。②DNA损伤传感器失活。Collis SJ等[7]通过研究认为，细胞内存在一种对细胞损伤的探测机制，当辐射引起的DNA DSB（辐射可以引起多种类型的细胞DNA损伤：包括单链断裂（single strand breaks，SSB），双链断裂（double strand breaks，DSB），碱基损伤和蛋白交联等）的数量达到一定阈值时，DNA损伤传感器激活，启动细胞的修复机制，使部分细胞损伤得以修复，从而降低细胞的损伤。在LDR放疗时，随着剂量率的降低，DNA DSB的数量减少。当剂量率下降到某一个阈值时，他所导致的DNA DSB的数量已不足以激活DNA损伤传感器，没有DNA损伤修复，最终结果是细胞损伤的数量反而超过剂量率高于该阈值时的数量，产生所谓的反剂量率效应。
3 持续低剂量率放疗对血管的损伤
Fajardo LF[8]了电离辐射导致血管损伤的形态和病理改变：电离辐射主要导致内皮细胞致死性和亚致死性损伤，造成微血管（毛细血管和血管窦）的破裂及血栓形成；中等直径的血管主要表现为新内膜增生、纤维素样坏死、血栓形成以及急性动脉炎；射线对大血管的损伤比较少见，而且静脉损伤多于动脉，主要有新内膜增生、动脉瘤、血栓形成以及管壁破裂。
血管的最初形成是由内皮细胞(vescular endothelial cell，VEC)的激活、迁徙以及增殖来完成的。正常的VEC和毛细血管的特点在许多病理状态下都发生了明显的变化。Mao[9]定量研究了电离辐射对VEC和毛细血管网形成的作用。通过体外试验模型，他评估了VEC在不同的照射剂量下（2Gy～6Gy）功能和动力学方面的变化。与对照组相比，在受照24h后 VEC出现了呈时间和剂量依赖的丢失；高剂量时血管的生成明显受阻；受照的VEC群停留在G1期的细胞比例增加；一个呈剂量依赖的DNA链损伤亦出现。这些结果表明：辐射诱导的VEC损伤破坏了血管的结构，而凋亡增加可能是VEC损伤的分子机制。
3.1 电离辐射对内皮细胞凋亡的影响
治疗性照射被广泛地应用于肿瘤治疗，放射治疗的成功不仅取决于肿瘤细胞的放射敏感性，同时也取决于肿瘤组织血管内皮细胞的放射敏感性。Kumar P等[10]发现p38 MAPK介导辐射引起的内皮细胞（VEC）的凋亡，而血管内皮生长因子（VEGF）通过磷酸肌醇-3激酶（PI3K）-AKt-Bcl-2途径来保护血管内皮细胞。他们在研究中发现p38 MAPK的抑制剂（PD169316）或拮抗剂可以显著提高VEC对γ射线的耐受，而PI3K-AKt-Bcl-2途径的抑制可以明显增加γ射线介导的p38 MAPK的活性，导致VEC凋亡增加。Bcl-2的表达在受照后的VEC内显著降低，而经VEGF处理后的受照VEC内Bcl-2表达维持在一个更高的水平。
抑癌基因p53主要调控DNA损伤后细胞的生长抑制和凋亡程序。Scott S等[11]研究发现p53在辐射致血管平滑肌细胞（VSMCs）DNA损伤时具有活性，而在其他原因如血管球囊扩张术等引起的VSMCs的损伤中没有活性。进一步的研究发现在上述两种损伤中p53表达是一致的，但对两类损伤却产生了完全不同的生物效应：只在受照后的VSMCs中导致了细胞生长抑制和凋亡增加。同时在受照后的VSMCs中由于DNA的损伤而引起的细胞周期蛋白D降解增加。因此，他们认为：在受照后的VSMCs中p53表达和功能是正常或增加，p53引起受照后的VSMCs的生长抑制和凋亡增加主要是由于细胞周期蛋白D这一关键的生长介质降解增加反作用于p53的结果。最近，Kaliski A等[12]的研究表明，当射线照射黑色素瘤细胞系B16 时，可以上调基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）的表达，进而促使其下游效应分子VEGF的分泌 ，结果导致瘤体内人微血管内皮细胞（human microvascular endothelial cell，HMEC）增殖和侵袭力增加，瘤体内血管生成。
3.2 电离辐射对内皮细胞增殖的影响
Fareh J等[13]报道，β线照射抑制血管平滑肌细胞增殖，且呈剂量依赖。血管内皮细胞的ED50（半数有效剂量）为2.15±0.10Gy, 血管平滑肌细胞ED50为1.08±0.12Gy。血管平滑肌细胞与内皮细胞的ED50比较显示；在一定辐射剂量条件下，辐射对血管平滑肌细胞增殖的抑制更大，对血管内皮细胞抑制较小。Henning E等[14]研究了188Re所释放的β和γ线对于人血管壁细胞增殖抑制的剂量特点，照射对血管内皮细胞（endothelial cells，EC）和人主动脉平滑肌细胞（human aortic smooth muscle cell，haSMC）的生长和克隆形成能力均有明显的抑制，而且呈剂量依赖关系：受照8Gy时haSMC的生长被完全抑制，而EC在受照16Gy时仍有部分增殖能力。Scott NA等[15]观察了低压X射线对血管平滑肌细胞和外膜细胞的抑制作用：和γ射线一样，低压X射线对这两种细胞的增殖也产生了明显的剂量依赖的抑制作用，与对照组相比受照射后24h～96h内，停留在细胞周期S期的细胞上升了65%，同时p53和p21（细胞周期抑制因子）的表达明显增加。因此，他们认为持续低剂量率照射能有效抑制血管平滑肌细胞和外膜细胞的增殖。这种抑制作用主要是对细胞分裂周期阻滞的结果，其分子机制是照射导致了细胞分裂周期抑制因子的表达增加。
3.3 电离辐射对内皮细胞与白细胞黏附的影响
辐射导致血管通透性增加，产生血管周围水肿和血管萎缩，微循环障碍影响血流和能量供应，从而导致缺血和代谢障碍、区域内结构的破坏。研究表明：电离辐射在体内外均可引起白细胞与受照血管内皮细胞的黏附增加，而这正是上述病理改变的分子基础，细胞间黏附分子（ICAM-1）及E-选择素等表达上调可能是其重要机制。黏附分子（adhesion molecule，AM）是一类介导细胞与细胞，细胞与细胞外基质间粘附作用的膜表面糖蛋白，目前主要分五大类：选择素家族，免疫球蛋白超家族，整合素家族，黏蛋白样家族，钙离子依赖的细胞黏附素家族。目前研究表明，与照射后白细胞和受照血管内皮细胞之间粘附增加有关的黏附分子有三类：选择素家族；免疫球蛋白超家族和整合素家族。转录因子NF-κB可调节这些黏附分子的表达，正常情况下NF-κB与拮抗剂κB（I-κB）结合滞留在细胞质中，在电离辐射或其他炎症介质的刺激下，I-κB磷酸化而失活，允许NF-κB进入细胞核而发挥转录活性，造成照射区域强烈的炎症反应。最近的研究表明NF-κB的激活提高了细胞存活、对抗外部刺激（如电离辐射）的能力[16]。
4 小 结
血管内皮细胞和血管平滑肌细胞是构成血管的主要结构，其中血管内皮细胞通过单层排列以及细胞间的连接形成血管内表面，其不仅是构成血管与组织间屏障的主要成分，而且具有多种重要的生理调节功能，在维持机体内环境稳定中发挥重要作用。电离辐射对血管的损伤从细胞角度看主要是对血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的损伤，具体表现在这两种细胞的凋亡增加，增殖抑制以及各种细胞因子炎症介质和炎性细胞引起组织受照区的炎性反应。
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