MMP-2、TIMP-2在口腔鳞状细胞癌中表达的临床病理研究
【摘要】 ［目的］研究口腔鳞状细胞癌（OSCC）组织中基质金属蛋白酶-2（MMP-2），基质金属蛋白酶组织抑制因子-2（TIMP-2）的表达。［方法］采用免疫组化SP法检测60例OSCC、35例非典型增生、20例正常口腔黏膜中MMP-2、TIMP-2的表达情况。［结果］ OSCC中MMP-2、TIMP-2的表达均高于非典型增生组（P<0.05），在非典型增生组中表达高于正常口腔黏膜组（P<0.05）。MMP-2的表达与肿瘤细胞分化程度、淋巴结转移密切相关（P<0.05），与年龄、肿瘤大小、TNM分期无关（P>0.05）。TIMP-2与肿瘤的淋巴结转移密切相关（P<0.05），与年龄、肿瘤大小、肿瘤细胞分化程度、TNM分期无关（P>0.05）。淋巴结转移组中MMP-2/ TIMP-2比值显著高于无淋巴结转移组（P<0.05）。［结论］MMP-2、TIMP-2是OSCC转移的重要生物学标志，MMP-2/TIMP-2比值对评估淋巴结转移的潜能有重要意义。
【关键词】 口腔鳞状细胞癌 免疫组织化学 基质金属蛋白酶-2 基质金属蛋白酶组织抑制因子-2
Expression of Matrix Metalloprateinase-2(MMP-2) and Tissue Inhibitors of Metalloproteinase-2(TIMP-2) in Oral Squamous Cell Carcionoma
Abstract: ［Purpose］ To study the expression of matrix metalloprateinase-2 (MMP2) and tissue inhibitors of metalloproteinase-2(TIMP-2) in oral squamous cell carcinoma (OSCC). ［Methods］ The expression of MMP-2 and TIMP-2 were examined by immunohistochemistry SP method in 20 cases with normal oral mucosa, 35 cases with atypical hyperlasia and 60 cases with oral squamous cell carcinoma.［Results］ The expressions of MMP-2 and TIMP-2 in OSCC were significantly higher than those in atypical hyperlasia（P<0.05）. The expressions of MMP-2 and TIMP-2 in atypical hyperlasia were significantly higher than those in oral mucosa（P<0.05）. MMP-2 expression in OSCC significantly associated with lymph node metastasis and cellular differentiation（P<0.05）, but has no relationship with age , tumor size and TNM stage（P>0.05）. TIMP-2 in OSCC significantly associated with lymph node metastasis（P<0.05）, but has no relationship with age , tumor size, cellular differentiation and TNM stage（P>0.05）. MMP-2/TIMP-2 in OSCC with lymph node metastasis was significantly higher than that in no lymph node metastasis（P<0.05）. ［Conclusion］ MMP-2 and TIMP-2 are important biological marker reflecting metastasis of OSCC andMMP-2/TIMP-2 may play an important role in evaluating lymph-node metastasis potential .
Key words: oral squamous cell carcionoma;immunohistochemistry; matri metalloprateinase-2; tissue inhibitors of metalloproteinase-2
细胞外基质（extracellular matrix，ECM）与基底膜（basement membrane，BM）是肿瘤转移的屏障，对ECM和BM的降解是肿瘤侵袭和转移的关键步骤。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是诱导ECM降解最重要的酶类。本项研究通过对基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）及其抑制物基质蛋白酶组织抑制因子-2（tissue inhibitors of metalloproteinase-2，TIMP-2）在正常口腔黏膜、非典型增生、口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）中表达的观察，探讨它们在OSCC发生、过程中的作用，以及与OSCC临床病理参数的关系。
1 材料与方法
1.1 资料来源
本研究所用石蜡包埋组织标本选自安徽医科大学第一附属1999年1月至2002年12月的住院患者。口腔鳞状细胞癌患者60例，均为口腔外科作口腔鳞状细胞癌根治性手术的患者，术前未作放疗或化疗，术后经病理诊断确诊为口腔鳞状细胞癌，男性28例，女性32例：年龄≤45岁34例，年龄>45岁26例，平均年龄48.01岁；肿瘤最大直径≤3cm者27例，>3cm者33例；有淋巴结转移者34例，无淋巴结转移者26例；肿瘤分期根据UICC标准TNM分期，Ⅰ期22例，Ⅱ期21例，Ⅲ+Ⅳ期17例；按鳞癌病理分级法，其中高分化鳞癌19例，中分化鳞癌24例，低分化鳞癌17例。口腔非典型增生病例35例，来自其他口腔疾病手术标本。正常口腔黏膜20例，取自口腔门诊活检标本，均未做过任何。
1.2 主要试剂
鼠抗人MMP-2、TIMP-2单克隆抗体，免疫组化SP试剂盒及DAB显色试剂盒均购自北京中山生物技术有限公司。
1.3 实验方法
所有组织均经10%甲醛固定，常规石蜡包埋， 包埋组织标本作4μm连续切片，分别做HE染色和免疫组化染色。免疫组化SP法染色参照试剂说明书进行，MMP-2、TIMP-2均采用高温直接煮沸法修复抗原。用已知的阳性切片作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。
1.4 结果判定
MMP-2、TIMP-2均以实质细胞胞膜或胞质出现明显的黄色或棕黄色颗粒判断为阳性着色。定量及图像分析采用同济医大千屏影像公司HPLAS-1000病理图像分析系统,将切片上的阳性染色信号转为灰度进行分析。
1.5 统计学处理
运用SPSS 10.0统计软件包进行统计分析，计量资料统计中多组之间使用方差分析以及q检验，两组之间使用t检验。
2 结 果
2.1 MMP-2、TIMP-2在正常口腔黏膜组织、非典型增生、口腔鳞状细胞癌中的表达和分布
MMP-2的阳性表达主要位于肿瘤细胞，增生上皮细胞、肿瘤间质中的纤维母细胞和微血管内皮细胞的胞膜、胞浆中，偶尔可见细胞核着色，阳性细胞呈片状、灶状或散在分布（图1、2）。MMP-2在正常口腔黏膜中亦有表达。表1显示从正常口腔黏膜、非典型增生到口腔鳞状细胞癌，MMP-2的净灰度值逐渐增高，OSCC组中MMP-2的净灰度值为 76.21±29.65，显著高于非典型增生（42.69±19.26，P<0.05），在非典型增生的净灰度值显著高于正常口腔黏膜的17.56±8.02（P<0.05）。
TIMP-2的阳性表达主要位于肿瘤细胞和增生上皮细胞的胞膜和胞浆中，呈异质性分布，阳性表达亦可见于少数间质细胞（图3）。TIMP-2在正常口腔黏膜组中表达微弱，从正常口腔黏膜、非典型增生到OSCC，TIMP-2的净灰度值逐渐增高，OSCC组中TIMP-2的净灰度值为51.04±22.81，显著高于非典型增生（37.41±13.85，P<0.05），在非典型增生的净灰度值显著高于正常口腔黏膜的15.97±8.51（P<0.05）。
OSCC中MMP-2/TIMP-2比值显著高于非典型增生与正常口腔黏膜（P<0.05）。
2.2 MMP-2、TIMP-2表达与OSCC临床病理参数间关系
MMP-2的表达与肿瘤淋巴结转移显著相关，在淋巴结转移组中MMP-2的净灰度值（87.56±35.91）显著高于非淋巴结转移组（62.09±29.87，P<0.05）。随着肿瘤分化程度的降低，MMP-2的表达增高，中、低分化组MMP-2的净灰度值显著高于高分化组（P<0.05）。MMP-2在患者年龄，肿瘤大小，肿瘤临床分期各组间的表达无显著性差异（P>0.05）。
TIMP-2在淋巴结转移组中的净灰度值（57.64±29.51）显著高于无淋巴结转移组（40.26±19.94，P<0.05）。TIMP-2在患者年龄，肿瘤大小，肿瘤分化程度，临床分期各组中的表达无显著性差异（P>0.05）。
在OSCC淋巴结转移组中，MMP-2/TIMP-2比值显著高于无淋巴结转移组（P<0.05），MMP-2/TIMP-2比值在患者年龄，肿瘤大小，肿瘤分化程度，临床分期各组之间的比较无显著性差异（P>0.05）。
3 讨 论
细胞外基质与基底膜的降解是肿瘤向邻近组织浸润进而向远处转移的必要步骤。MMPs是诱导ECM降解最重要的酶类，目前已明确的人类MMPs有20余种，根据其作用底物的不同分为四类：间质胶原酶、明胶酶、间质溶解素、膜型金属蛋白酶（membrane-type metalloprateinase，MT-MMP）。其中明胶酶包括MMP-2、MMP-9，分子量分别为72kD、92kD，主要底物有明胶、Ⅳ、Ⅴ型底膜胶原。TIMPs是MMPs的专一抑制剂可以通过结合MMPs的活性部位，影响MMPs分子对基底物的结合而实现其抑制作用，这种结合是以非共价键方式，而且不可逆转[1，2]。目前已发现4种TIMP，分别命名为TIMP1~4，其中TIMP-2是分子量为21kD的糖蛋白，它可与MMP-1、MMP-2和MMP-3呈1:1结合，其中对MMP-2的抑制作用较TIMP-1强7~10倍以上，而对MMP-1的抑制作用较TIMP-1弱， TIMP-2除能与活性MMP-2结合抑制其活性外，还能以非共价键与明胶酶原结合，从而抑制明胶酶原的活化，与明胶酶原结合的TIMP-2仍能抑制MMP-2的活性[3]。
我们用免疫组化SP法检测了 60例OSCC，35 例非典型增生， 20 例正常口腔黏膜中MMP-2蛋白的表达，从正常口腔黏膜、非典型增生到OSCC，MMP-2的表达逐渐增高，MMP-2在正常口腔黏膜中表达微弱，净灰度值为17.56±8.02，在OSCC中的净灰度值为76.21±29.65 ，提示MMP-2在OSCC发生过程中具有重要意义，与报道结果一致[4，5]。在实验中观察到在OSCC组织中MMP-2在肿瘤细胞和间质细胞中均有分布，并在肿瘤浸润的前缘，癌巢的周边部分表达明显增多，提示癌巢边缘细胞及肿瘤浸润前缘的细胞是一群获得浸润和转移特性，增生活跃的细胞亚群，它们能够诱导MMP-2产生，降解ECM和癌巢基底膜，因而具有较高的侵袭潜能。有研究表明[6]，成纤维细胞在生理状况下很少表达MMPs，然而OSCC肿瘤细胞膜上的MT-MMP可诱导成纤维细胞中MMP-2的活化，OSCC肿瘤细胞的培养上清液亦可促进成纤维细胞中MMP-1的表达，OSCC肿瘤细胞与成纤维细胞共同培养可促进肿瘤的浸润与转移，我们在实验中也观察到MMP-2在肿瘤间质中的表达主要位于成纤维细胞的胞膜和胞浆中，提示OSCC肿瘤细胞与其周围成纤维细胞中MMP-2的表达和活化之间存在着一定的联系。实验中还观察到在肿瘤细胞周围MMP-2的表达由远及近存在着由阴性逐渐变为阳性的趋势，提示肿瘤细胞可以通过可溶性介质或膜结合分子与间质细胞进行信息变换协同产生和调节MMP-2。在对乳腺癌、前列腺癌、胃癌等多种肿瘤进行研究表明，在不同的肿瘤组织中，MMP-2有不同程度的升高并与肿瘤的进展和预后有关。本实验中MMP-2在OSCC低分化组中的表达高于高分化组，在淋巴结转移组中的表达高于无淋巴结转移组，提示MMP-2的表达与肿瘤的恶性度和侵袭能力呈正相关，MMP-2可以作为临床工作中判断OSCC预后的分子指标，与不良预后有关。
TIMP-2在鳞癌组中的表达与正常口腔黏膜组和不典型增生组比较，均有显著性差异，显示细胞在发生癌变过程有通过TIMP-2表达的上调抑制癌细胞浸润转移的特性。本研究显示MMP-2、TIMP-2在淋巴结转移组中的表达均高于无淋巴结转移组，在OSCC淋巴结转移组中MMP-2/TIMP-2比值显著高于无淋巴结转移组，提示随着肿瘤浸润和转移，MMP-2与TIMP-2的表达均有上调，但在淋巴结转移组中MMP-2的上调幅度大于TIMP-2。
我们认为宿主对MMP-2的上调存有复杂的反馈机制，可以诱导更多的TIMP-2产生，高表达的TIMP-2不仅抑制MMP-2对基质的降解，还可抑制MMP-2对肿瘤中新生血管形成的促进作用，但MMP-2上调程度超过TIMP-2时仍会造成MMP-2/ TIMP-2系统的失衡，造成肿瘤的侵袭和转移，实验结果提示，与MMP-2、 TIMP-2两个指标相比， MMP-2/TIMP-2比值的检测对评估OSCC淋巴结转移潜能具有更为重要的意义。
【文献】
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