SELDI-TOF-MS技术检测肺腺癌血清生物标志物
作者：廖萍 王文静 朱佩云 刘茶珍 陆晔 刘国星 罗晓阳 项翠琴
【摘要】 ［目的］ 用表面增强激光解析离子化飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）技术寻找肺腺癌病人血清蛋白标志物，探讨吸烟与肺腺癌血清中蛋白质组谱变化的关系。［方法］ 收集肺腺癌病人和正常对照人群血清各50例，按照年龄、性别、吸烟史进行一一配对，采用WCX2芯片技术对血清蛋白进行捕获，用蛋白芯片阅读器PBSⅡ对芯片进行扫描、分析。［结果］ 肺腺癌病人血清蛋白图谱与正常对照组相比，存在10个差异表达蛋白（P<10-5），其中包括6个高表达蛋白，分子量分别是4050Da、4205Da、5329Da、5899Da、7761Da、9285Da，4个低表达蛋白，分子量分别是2564Da、2932Da、3082Da、3442Da。肺腺癌病人有吸烟史的与不吸烟的进行比较，血清蛋白表达差异无显著性（P>0.01）。［结论］ SELDI-TOF-MS技术能筛选出灵敏度和特异性较好的差异蛋白，为肺腺癌的早期发现提供了一种新的、无创实验方法。
【关键词】 表面增强激光解析离子化飞行时间质谱技术 肺腺癌 蛋白质组学
Detection of Serum Protein Biomarkers by Surface-Enhanced Laser Desorption and Ionization Time of Flight Mass Spectrometry(SELDI-TOF-MS) in Patients with Lung Adenocarcinoma
Abstract: ［Purpose］ To search specific protein biomarker by SELDI-TOF-MS in lung adenocarcinoma patients and to investigate the relationship between smoking and protein biomarkers in lung adenocarcinoma. ［Methods］ Fifty cases with lung adenocarcinoma and 50 controls werematched by gender, age and history of smoking. WCX2 PoteinChip was used to capture serum protein followed by PBSⅡ analysis. ［Results］ Compared with normal control, ten protein biomarkers were identified including six highly expressed potential protein biomarkers with relative molecular weights of 4050, 4205, 5329,5899, 7761, 9285Da respectively. Four low expressed potential protein biomarkers with relative molecular weights of 2564, 2932, 3082, 3442Da respectively. There was no statistical difference in serum protein between smoker and non-smoker in patients with lung adenocarcinoma(P>0.01). ［Conclusion］ Some potential protein biomarkers with higher sensitivity and specificity can be screened by SELDI-TOF-MS technique which provides a new and noninvasive method for early detection of lung adenocarcinoma.
Key words: SELDI-TOF-MS; lung adenocarcinoma; proteomics
据统计肺癌在世界肿瘤发病率中居第一位[1]。流行病学研究表明吸烟是肺癌最重要的病因之一[2]。临床资料表明，80%肺癌患者就诊时已属晚期，失去了手术根治的机会，放疗化疗效果不佳，5年生存率不到15%；而早期肺癌手术后5年存活率达70%[3]。一些肿瘤相关因子的检测，如癌胚抗原，存在特异性低、灵敏度低等缺点，因此，寻找敏感性、特异性高的早期诊断方法，是目前研究如何早期干预肺癌发生的有效途径之一。
上世纪90年代中期，国际上产生了一门新兴学科——蛋白质组学（Proteomics），它是以细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象。由于肿瘤细胞代谢强，所以理论上在其发生发展过程中会分泌一些特异性的蛋白质，这些蛋白质在肿瘤发生初期转移前就应该存在了，研究不同时期细胞蛋白质组成的变化，如蛋白质在癌症患者内与正常个体中的表达差异，以发现有差异的蛋白质种类为主要目标建立了一系列实验方法，其中表面增强激光解析离子化飞行时间质谱（surface-enhanced laser desorption and ionization time of flight mass spectromerty，SELDI-TOF-MS）技术是近年来飞速发展的蛋白质组学技术之一，它是一种快速、有效、微量、稳定性好的筛选疾病分子标记方法，可以分析低分子量(<25000Da)、低浓度（fmol级）蛋白质信息，并且可以测定疏水蛋白质。2001年底以来，国外采用该技术筛选了乳腺癌[4]、前列腺癌[5]、肾癌[6]、膀胱癌[7]等多种肿瘤疾病，检测血液、组织提取液、尿液、乳腺流出液等多种体液，获得了一些灵敏度高、特异性好的标志蛋白。本研究拟采用SELDI-TOF-MS技术检测肺腺癌患者与正常人血清中蛋白质，比较其蛋白质谱的差异，以期建立一种早期、微量、快速、简便的肺癌诊断方法，并探讨吸烟与肺癌发生的关系。
1 材料与方法
1.1 对 象
50例肺腺癌病人术前血清来源于上海市第六人民2002~2004年间门诊或住院病例，正常对照血清50例，来源于本中心出国体检人群。根据年龄、性别、吸烟史的有无进行一一配对。
1.2 主要试剂与仪器
乙酸钠、乙腈、三氟乙酸、SPA（Sigma，德国）。蛋白芯片（protein chip）弱阳离子芯片（WCX2）（Ciphergen，美国）。Protein Chip Biomarker System Ⅱ（PBSⅡ）质谱仪(Ciphergen，美国)， Freedom EVO型自动加样器（Tecan，瑞士），超纯水制备仪（Millipore，美国）。
1.3 步 骤
血清样品准备：抽取肺腺癌患者和正常人群静脉血2ml，置于4℃冰箱中1~2h，然后4℃，3000r/min离心10min，取上层血清分装后，置-80℃冰箱内保存。
芯片预平衡：取WCX2芯片装在Bioprocessor加样架上，每孔加入50mM pH4.0乙酸纳（NaAc）200μl，置于水平摇床上振荡5min，弃溶液，重复上述步骤1次。
血清样品稀释：取1.5ml的离心管，加入234μl 50mM pH 4.0 NaAc缓冲液，取6μl血清样品至离心管中，反复吹打几次，使样品充分混匀。血清样品制备及稀释均在碎冰上进行以防蛋白质降解。
上样：取稀释好的血清样品200μl加入平衡好的芯片上，放于摇床上孵育1.5h。
洗脱：将孵育好的芯片内样品弃去，每孔加入50mM pH 4.0 NaAc 200μl，置于水平摇床上振荡5min，弃溶液，重复上述步骤1次。
加能量吸收分子：将芯片从Bioprocessor中取出，每孔加能量吸收分子SPA 0.5μl，滴加2次。
数据收集：待芯片干燥后，放入Protein Chip Biomarker System Ⅱ质谱仪进行数据收集。用Ciphergen proteinchip3.0软件自动采集数据，统一采用激光强度为160，灵敏度为8的模式，每两位采集一次数据，对芯片进行扫描。
1.4 统计方法
将50对肺癌患者和正常对照者的血清蛋白质谱图标准化后，用BioMarker Wizard软件分析肺癌患者和正常对照者血清蛋白质谱的差异， BioMarker Wizard软件自动标记蛋白峰，设定有意义的峰，其出现频率阈值为20%，信噪比最低值为5，对两组进行统计学分析两组之间蛋白峰强度比较，P<10-5时有统计学意义。
2 结 果
2.1 肺腺癌病人与正常人血清蛋白质谱图的比较
将50对按性别、年龄、吸烟史的有无一一配对的肺腺癌病人与正常人血清加于WCX2芯片上，用PBSⅡ质谱仪进行数据采集（见图1）。肺腺癌病人与正常人血清蛋白质谱图的比较，肺腺癌病人血清中发现高表达的蛋白质有6个蛋白峰在肺癌患者血清中呈现高表达，分子量分别是4050Da、4205Da、5329 Da、5899Da、7761Da、9285Da(见表1)；肺腺癌病人血清中发现低表达的蛋白质有4个蛋白峰在肺癌患者血清中呈现低表达，分子量分别是2564Da、2932Da、3082Da、3442Da（见表2）。每个峰在50例病人中出现的频率＞90%。
2.2 肺腺癌病人血清中蛋白标记物的灵敏度和
特异性
设定肺腺癌病人在血清中高表达的蛋白质在图谱上相对丰度大于等于其平均值定为阳性，小于等于病例平均值为阴性。各蛋白峰的灵敏度和特异性(表1、表2)，可以看出，3082Da 、4050Da、4205 Da、7761Da蛋白峰的灵敏度为72%~88%，特异性74%~94%，均较好，该类蛋白联合应用可考虑作为肺腺癌标志蛋白。10个蛋白峰联合应用作为肺腺癌病人的蛋白指纹图谱诊断灵敏度高达80%，特异性高达90%。
2.3 吸烟的肺癌病人与不吸烟的肺癌病人血清蛋白图谱的差异
软件分析结果，吸烟的肺腺癌病人与不吸烟的肺腺癌病人血清蛋
白图谱差异不明显。
3 讨 论
肺癌早期一般无明显症状，运用肺癌临床诊断和实验室诊断依据，难以发现早期肺癌，且一些实验室诊断指标存在灵敏度不高，特异性低等缺点，因此很有必要寻找一种有效的实验室方法，早期辅助诊断肺癌，提高诊断的灵敏度和特异性。
肺癌的病分类分为非小细胞癌和小细胞癌，常见的非小细胞癌包括鳞状细胞癌、腺癌和大细胞未分化癌。近年来，腺癌的发病率高于鳞癌，本次实验以肺腺癌为研究对象，收集肺腺癌病人血清样品，筛选出10个肺癌相关标志蛋白，其中肺癌病人血清中高表达的蛋白有6个，灵敏度为66%～88％，特异性为74%～94％，低表达的蛋白4个，灵敏度为56%～82％，特异性为64%～82％，10个蛋白峰联合应用作为肺腺癌病人的蛋白指纹图谱诊断灵敏度高达80%，特异性高达90%。其中3082Da 、4050Da、4205Da、7761Da蛋白峰的灵敏度为72%~88%，特异性74%~94%，均较好，表明该类蛋白联合应用有可能作为早期诊断肺腺癌的标志蛋白。
吸烟是引起肺癌的最重要原因之一，从组织学范畴来讲，吸烟主要引起上皮样、小细胞及退行性细胞发生癌变。通过本次实验研究，将吸烟的肺腺癌与不吸烟的肺腺癌患者血清蛋白图谱进行统计学分析，未发现有差异蛋白，说明吸烟与肺腺癌不存在明显关系，从而验证了组织学的研究。
本次设计的实验全自动化操作，避免了人为的操作误差；研究对象的选择经过严格的流行病学配对，包括年龄、性别、有无吸烟史等，根据病理学分类，选取单一肺腺癌进行筛选，减少了多种复杂因素对肿瘤发生的影响，使实验结果易于分析。为了进一步确认这些肺腺癌相关蛋白，我们将对部分已手术病人进行动态监测，观察放化疗是否对这些蛋白峰有影响，然后对较好的肺腺癌蛋白标志物进行提取、鉴定。此外，我们还将继续研究肺腺癌不同临床分期的血清蛋白质变化，为临床诊断提供更多依据。
SELDI-TOF-MS技术近年来飞速发展，研究领域包括了肿瘤、传染病、呼吸系统疾病、神经系统疾病等。近期Ebert等[8]利用SELDI-TOF-MS技术对胃癌和健康人血清进行研究，建立了一个包含50个决策树的分类模型，在诊断胃癌的特异性和敏感性都达到100% 。Kang等[9]研究急性SARS和甲型流行性感冒、肺炎、肺癌、健康对照组血清蛋白质的变化，发现4个新的标志物，组成了模式识别分类树，它诊断SARS的敏感性和特异性分别为97.3％和99.4％。目前，北京师范大学生命学院细胞研究所的何大澄、肖雪媛等[10]也筛选出了一些标志分子，并且对两种不同芯片捕获血清蛋白的能力作了比较。国外针对肺癌的SELDI-TOF-MS实验报道也不多。
综上所述，蛋白质芯片技术是一种简便、微量、快速、高效的寻找肿瘤相关蛋白的技术，为临床的实验室诊断提供了一种新的无创、快速、灵敏度及特异性较好的辅助诊断技术。
【】
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