ILKmRNA在结肠癌细胞株中的表达及其稳定表达的RNA干扰载体构建
【摘要】 ［目的］ 检测结肠癌细胞株中ILK的mRNA水平，并构建针对ILK基因的特异性RNA干扰(RNAi)表达载体。［方法］ 通过RT-PCR检测ILK基因在三种结肠癌细胞株（SW480、LO-VO及HT29）mRNA的表达；根据GenBank提供的ILK基因mRNA序列，设计具有小发夹结构的两条DNA序列，化学合成后经退火形成双链DNA片段，连接到经HindⅢ／BglⅡ酶切线性化的pSUPER-neo-EGFP／H1（pSNE/H1）质粒上，形成重组载体pSNE-ILK，转化大肠杆菌DH5α，提取质粒经HindⅢ/EcoRⅠ双酶切鉴定和测序鉴定，稳定转染结肠癌细胞HT29。［结果］ ①RT-PCR检测，ILK基因在三种结肠癌细胞株中均有表达，ILK/β-actin电泳条带强度比：SW480为0.63，HT29为0.65，LO-VO为0.33。②成功构建了针对ILK基因的特异性RNA干扰载体pSNE-ILK和对照的无关基因载体pSNE-Control，并稳定转染结肠癌细胞株HT-29。［结论］ 成功构建了针对ILK基因的特异性RNAi载体，并稳定转染HT29细胞，能有效抑制ILK基因，为下一步探讨ILK基因在结肠癌进程中的作用和结肠癌的基因奠定了基础。
【关键词】 RNA干扰 载体构建 RT-PCR 整合素连接激酶
Expression of ILK mRNA in Colon Carcinoma Cell Lines and Construction of ILK-RNAi Stable Expressing Vector
Abstract： ［Purpose］ To investigate the expression of ILK mRNA in the colon carcinoma cell line and to construct novel ILK-RNAi(RNA interference) vector. ［Methods］ The expression of ILK mRNA was detected by RT-PCR in three colon carcinoma cell lines（SW480, LO-VO and HT29）. Specific short chain oligonucleotide was designed using the RNAi software according to the mRNA sequence provided by GeneBank，the oligonucleotides was gained through annealing after chemosynthesis and was inserted into HindⅢ/BglⅡlinearized pSUPER-neo-EGFP/H1（pSNE/H1）plasmids. The recombinant expression vector was evaluated using enzyme cutting and sequencing．The right vectors were stably transfected into HT29 cells． ［Results］ The numerical value of ILK/β-actin were detected to evaluate expression of ILK mRNA in the three colon carcinoma cell lines: SW480, 0.63; HT29, 0.65 and LO-VO, 0.33. pSNE-ILK and pSNE-Control had been constructed successfully.［Conclusion］ The ILK-targeted RNAi vector is constructed successfully then transfected into HT29 cells，and it can effectively inhibit the expression of target gene and may be potentially useful in gene therapy of ILK related colon carcinoma.
Key words：RNA interference；vector construction；RT-PCR；integrin-linked kinase
免疫染色强度与肿瘤细胞的浸润深度、淋巴转移以及肿瘤的分级、分期呈正相关[7]。
RNA干扰（RNA interference，RNAi）[8]是由与靶基因序列同源的双链RNA所诱导的一种特异性的转录后基因沉默现象，它是通过降解具有同源序列靶基因的mRNA，达到阻止基因表达的作用，使细胞表现出特定基因缺失的表型的过程，具有高特异性、高稳定性、高效率性、高穿透性、能同时抑制多个基因等特性[9]。RNAi是基因沉默的理想工具，可以直接用于疾病相关基因的抑制，从而达到疾病治疗或预防的目的。本实验是通过RT-PCR技术，检测ILK mRNA在结肠癌细胞系中表达情况，并构建其特异性的RNA干扰载体，抑制ILK基因表达，为结肠癌基因治疗提供了理论依据。
1 材料与方法
1．1 细胞株、质粒及菌株
结肠癌细胞株SW480、HT29、LO-VO细胞为本实验室保存。含EGFP的pSUPER-neo siRNA 表达载体（pSNE）由本校戚华兵博士、何建明博士惠赠；大肠埃希菌DH5α为本实验室保存。
1．2 主要试剂
限制性内切酶HindⅢ、BglⅡ和EcoRⅠ为New England Biolab公司产品；RT-PCR试剂盒、T4DNA连接酶、DL2000 DNA Marker及λ-HindⅢ DNA Marker为TaKaRa公司产品；质粒DNA提取纯化试剂盒和胶回收试剂盒为BioDev公司产品；H-DMEM培养基为Hyclone公司产品；新生牛血清为民海公司产品；G418为AMRESCO公司产品；TRIzol、Lipofectamine 2000为Invitrogen公司产品。引物均由上海生工公司合成。
1．3 方 法
1．3．1 结肠癌细胞总RNA的提取
采用TRIzol法抽提总RNA（具体方法参见Invitrogen公司的TRIzol说明书）。
1．3．2 RT-PCR
应用软件按照引物设计原则，设计ILK基因的上游引物5′-GCACTCAATAGCCGTAGTG-3′，下游引物5′-CCTACTTGTCCTGCATCTTC-3′，产物长度为406bp。用β-actin作内参照：上游5′-GTCCTGTGGCATCCACGAAAC-3′，下游5′-GCTCCAACCGACTGCTGTCA-3′，产物长度为500pb。RT-PCR反应体系参照TaKaRa公司产品说明书。RNA逆转录为cDNA，经PCR扩增：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，循环30次，最后72℃延伸10min。取PCR扩增产物8μl于1%琼脂糖凝胶上电泳。阳性为2条带,分别为406bp的ILK条带和500bp的β-actin。用Bio-Rad公司的GS-250 Molecular Analysis程序使PCR产物条带在机上显像，并应用BandScan软件分析ILK基因与β-actin条带光密度比，比值小于0.1时为阴性或低度表达，比值大于0.1小于0.4时为中度表达，大于0.4为高度表达。
1．3．3 RNA干扰载体的构建
根据报道ILKsiRNA序列[10]及已发表的基因库中ILK基因的mRNA序列，利用软件设计，按照Oligoengine提供的pSUPER-RNAi System中构建发夹状短链RNA的原则，5′→3′分别为BglⅡ酶切位点＋靶向正义链＋发夹状结构＋靶向反义链＋终止序列HindⅢ酶切位点，设计为：senseILK为：
5′-GATCCCCCTCGTTGAGCTTCGTCAGGTTCAAGA-
GACCTGACGAAGCTCAACGAGTTTTTA-3′，antisenseILK为：5′-AGCTTAAAAACTCGTTGAGCTTCGT-
CAGGTCTCTTGAACCTGACGAAGCTCAACGAGGG-G-3′。无关基因对照组sense-Control为：5′-GATCCCCTCCGTTGAGCTTCGTCAGGTTCAAGAGA-CCTGACGAAGCTCAACGGATTTTTA-3′，antisense-Control为：5′-AGCTTAAAAATCCGTTGAGCTTCGT-
CAGGTCTCTTGAACCTGACGAAGCTCAACGAGGG-G-3′。将合成的单链稀释为3μg/μl，退火成双链，于4℃保存。用BglⅡ及HindⅢ双酶切质粒pSNE，1.0%琼脂糖凝胶电泳30min，纯化回收线性化质粒pSNE（按照BioDev胶回收试剂盒说明书进行）。T4DNA连接酶连接线性化质粒pSNE和退火产物，以线性化质粒pSNE和灭菌水连接做阴性对照。4℃连接过夜后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞（感受态细胞制备和转化参照《分子克隆指南》），在氨苄青霉素抗性的LB平板上37℃培养过夜筛选，随机挑取菌落，扩增培养后，抽提并纯化质粒，用EcoRⅠ及HindⅢ双酶切，1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定（阳性为281bp，阴性为227bp）。酶切鉴定正确的进一步测序鉴定。
1．3．4 RNA干扰载体细胞转染
应用Lipofectamine 2000转染结肠癌细胞HT-29。转染前一天，用0.25％胰酶溶液消化对数生长期的HT-29细胞，制成单细胞悬液，接种到24孔板中，接种密度大约为1.5×105/孔，每孔加入500μl含20%小牛血清的H-DMEM培养液。转染步骤详见Invitrogen的Lipofectamine 2000产品使用说明书。转染48h后可在荧光显微镜下观察到绿色荧光。以1000μg/ml浓度的G418压力筛选，以未转染的HT-29细胞为阴性对照。获得稳定表达的HT-29/pSNE-ILK细胞后，做RT-PCR进一步验证干扰效率，干扰效率＝（1-干扰组/对照组）×100%。
1．3．5 统计学方法
各项计量资料均以x±s表示，应用SPSS 13.0版统计分析软件进行数据分析，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2．1 ILK mRNA在结肠癌细胞系中的表达
经RT-PCR扩增，ILK基因扩增片段长度为406bp，β-actin扩增片段长度为500bp，与实验设计符合。电泳结果直接用Bio-Rad凝胶摄影系统保存，用BandScan软件进行分析，2条带光密度比( ILK/β-actin)为基因表达的相对值：SW480细胞为0.63，HT29细胞为0.65，均高表达；LO-VO细胞为0.33，中度表达（见图1）。
2．2 表达载体的构建及鉴定
退火产物与线性化载体连接后，转化大肠菌DH5α，平板上有数十个菌落生长，阴性对照无菌落生长，各随机取4个菌落，扩大培养后，抽提质粒，以HindⅢ和EcoRⅠ双酶切分析（双酶切pSNE质粒作为阴性对照）。其中1~4号为pSNE-ILK质粒，5~8号为pSNE-Control质粒，9~10号为pSNE质粒。2、3、4、5、7号质粒能被切出281bp大小的片段，8、9、10号能被切出227bp大小的片段（见图2）。送4、5号质粒到上海生工测序，测序结果证明载体pSNE-ILK及对照载体pSNE-Control构建成功（见图3）。
2．3 RNA干扰载体的细胞转染荧光显微镜观察
应用Lipofectamine 2000转染结肠癌细胞HT29。转染48h荧光显微镜下观察可见较多绿色荧光，转染率约为25%。以1000μg/ml的G418压力筛选，10d时对照组细胞全部死亡，继续筛选4d，培养皿中仅见带有荧光的细胞，并形成稳定表达的克隆，改为低浓度G418（400μg/ml）维持扩大培养。细胞系HT29/pSNE-ILK构建成功（如图4）。提取RNA并做RT-PCR，以ILK/β-actin为表达的相对值（做3次取平均值），HT-29/pSNE-ILK细胞为0.16±0.11，HT29/pSNE-Control细胞为0.53±0.10，HT29细胞为0.64±0.11，第一组分别与后两组细胞比较存在显著差异，有统计学意义（t分别为6.41及7.56，P<0.05），后两组比较差异无统计学意义。pSNE-ILK载体对HT29细胞的ILK mRNA干扰效率达69.8％。
3 讨 论
对于中晚期结直肠癌患者，最主要的手段是化疗，而化疗效果却不尽人意，基因治疗成为目前研究较热门的方法之一。RNA干扰技术是通过降解具有同源序列靶基因的mRNA，达到基因敲除，进而阻止该基因表达的作用，使细胞表现出特定基因表型缺失的过程[8，9]。
ILK是一种新近发现的丝/苏氨酸蛋白激酶[8]，参与多种信号传导通路。许多研究证明ILK是调节体内许多生物进程（如增殖、黏附、凋亡和转移）的关节点[4，5]。国外研究显示，ILK的表达量与前列腺肿瘤、黑色素瘤、卵巢癌的形成密切相关，且表达量的高低与肿瘤细胞的恶性程度、浸润和转移能力呈正相关[7，11~14]。目前已有研究显示，通过抑制ILK来抑制PKB的活性，能够导致大肠癌细胞的程序性死亡和G1~S期细胞周期的停滞[15]，因此，我们推测，ILK可能成为今后治疗结肠癌的一个理想靶点[16]。
我们通过本实验证实，在不同结肠癌细胞系中，ILK mRNA均有表达，并且表达强度均在中度以上，这与国外相关报道一致[4，5]。而正常结肠内膜中，ILK无表达或表达极其微弱，无法测出[4，5，17]。因此我们推测ILK在结肠癌的形成和转移中可能起着非常重要的作用，而现在阻断ILK基因的抗体或者药物非常稀少，并且十分昂贵，因此我们构建针对ILK基因的特异性RNA干扰载体，阻断ILK基因的表达，以达到基因沉默的效果，为研究ILK基因在结肠癌的作用开辟了新的途径。本实验中，我们成功构建了针对ILK基因的RNAi载体pSNE-ILK，并稳定转染HT29细胞，经G418压力筛选，获得稳定表达细胞系HT29/pSNE-ILK。经RT-PCR证明，pSNE-ILK对ILK基因有显著的干扰作用，可以满足实验要求。这为下一步探讨ILK基因在结肠癌的基因研究及治疗中的作用提供了新思路。
【】
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