巨噬细胞中诱导型一氧化氮合酶来源的NO对共培养HL60细胞凋亡的影响
【摘要】 目的 研究巨噬细胞中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）来源的一氧化氮（NO）对共培养HL60细胞凋亡的影响。方法 以脂多糖（LPS）和γ?干扰素（INF?γ）诱导RAW264.7巨噬细胞iNOS基因的表达产生过量NO为实验模型，通过噻唑蓝（MTT）试验、蛋白质印迹分析、荧光分析、流式细胞术（FCM）、透射电镜和DNA琼脂糖凝胶电泳等分析技术，观察NO对共培养的HL60细胞存活率、bcl?2和bax蛋白表达、Caspase?3活性和细胞凋亡的影响。结果 RAW264.7巨噬细胞中iNOS来源的NO对共培养HL60细胞能造成氧化损伤，降低细胞的存活率；bcl?2表达明显下降，而bax表达增加；激活Caspase?3和促进DNA的降解。结论 巨噬细胞中iNOS来源的NO在诱导细胞凋亡中发挥重要的作用。
【关键词】 诱导型一氧化氮合酶；一氧化氮；细胞凋亡；巨噬细胞
Effects of Inducible Nitric Oxide Synthase Derived Nitric Oxide on Apoptosis of HL60 Cells Co?cultured with RAW264.7 Macrophages
Abstract：Objective To study effects of inducible nitric oxide synthase（iNOS）?derived nitric oxide（NO） on apoptosis of HL60 cells co?cultured with RAW264.7 macrophages.Methods Upon stimulation with lipopolysaccharide (LPS) and interferon?γ(IFN?γ), inducible nitric oxide synthase gene was expressed in RAW264.7 macrophages, which caused the consequent generation of nitric oxide. Effects of nitric oxide on HL60 cells viability, expression of bcl?2 and bax protein, activity of Caspase?3 and cell apoptosis were evaluated with MTT assay, Western blot analysis, fluorescence analysis, flow cytometry（FCM）, transmission electron microscopy （TEM）and DNA agarose gel electrophoresis.Results The results showed that iNOS?derived nitric oxide caused oxidative damage of HL60 cells co?cultured with RAW264.7 macrophages, and decreased cell viability, and evidently reduced expression of bcl?2 and increased expression of bax, and induced activity of caspase?3 and DNA fragmentation.Conclusion The results suggested important effect of iNOS?derived nitric oxide on apoptosis of cells in RAW264.7 macrophages.
Key words：Inducible nitric oxide synthase; Nitric oxide; Apoptosis; Macrophage
0 引言
巨噬细胞是一种参与机体非特异性免疫防御的重要免疫细胞。1988年Hibbs首先证明哺乳动物的巨噬细胞能产生NO [1]，现已证实，NO是一种具有重要生理、病理功能的内源性生物信息分子，在生物体内，NO由三种不同的一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase，NOS）催化L?精氨酸而生成，其中可诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase，iNOS)是在诱导因素作用下，由巨噬细胞、中性粒细胞、胶质细胞等产生，其活性不受Ca2+浓度的影响，生成NO量大，主要作用是参与炎症反应和免疫细胞对病原体的防御。但过量的NO可与超氧阴离子（O2·－）迅速反应，生成具有强氧化性的过氧化亚硝基阴离子（ONOO－） [2]，ONOO－引起的氧化损伤是NO具有细胞毒性的重要原因之一 [3,4]。本研究以脂多糖（LPS）和γ?干扰素（INF?γ）诱导RAW264.7细胞iNOS基因的表达产生过量NO为模型，通过MTT试验、蛋白质印迹分析、荧光分析、透射电镜、DNA琼脂糖凝胶电泳等分析技术，观察NO对共培养的HL60细胞存活率、bcl?2和bax蛋白表达、Caspase?3活性和细胞凋亡的影响。为与NO相关疾病的防治提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
RAW264.7细胞株及HL60细胞株（中科院上海细胞生物学研究所），细胞培养瓶(Costar公司)，DMEM培养基及RPMI?1640培养基（Gibco BRL公司），胎牛血清（Hyclone公司），LPS、INF?γ、RNase A、Nω?硝基?精氨酸（Nω?nitro?L?arginine，L?NNA）、PVDF膜（Sigma公司），UNIQ?10柱式总RNA提取纯化试剂盒（上海生工公司）；Access Quick RT?PCR试剂盒（Promega公司），蛋白酶K（Merck公司），兔抗bcl?2、bax多抗（Santa Cruz公司），增强化学发光检测试剂盒（Pierce公司），其余为国产分析纯试剂。
1.2 细胞的培养及处理
将复苏的RAW264.7细胞和HL60细胞分别接种于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI?1640培养基中，置5%CO2、37℃培养箱，待细胞生长至对数生长期时用于实验。实验前换成无血清的RPMI?1640培养基，将RAW264.7细胞分为对照组（不经过LPS和IFN?γ诱导）、LPS组（用终浓度为1μg/ml LPS和100U/ml IFN?γ诱导）、LPS＋L?NNA组（用终浓度为1μg/ml LPS和100U/ml IFN?γ诱导，同时加入终浓度为400μmol/L L?NNA）。
1.3 RAW264.7细胞产生的NO的检测
采用ESR自旋捕集技术检测RAW264.7细胞产生的NO。RAW264.7细胞培养于25cm2细胞培养瓶中，经过LPS和IFN?γ诱导24h后，加入1mmol/L NO捕集剂(DETC)2?Fe2+，继续培养3h后收集细胞培养的上清液，经乙酸乙酯萃取，用波谱仪检测其顺磁共振（ESR）波谱。
1.4 RT?PCR分析
RAW264.7细胞经LPS和IFN?γ处理一定时间后，用Trizol试剂提取RNA，用Promega Access QuickTM RT?PCR试剂盒进行RT?PCR扩增以分析iNOS基因的转录水平，用GAPDH作为内参物。PCR引物设计参照 [5]，由上海生工公司合成。iNOS引物序列：5′?GTG TTC CAC CAG GAG ATG TTG?3′/ 5?′CTC CTG CCC ACT GAG TTC GTC?3′， 扩增片段长度576 bp； GAPDH引物序列：5′?GAA GGG TGG GGC CAA AAG?3′/5′?GGA TGC AGG GAT GAT GTT CT?3′，扩增片段长度295 bp。扩增产物经1.5 %琼脂糖凝胶电泳检测，并用UVP凝胶成像系统进行扫描分析。
1.5 共培养HL60细胞存活率的检测
将分别诱导24h、12h、6h、0h的RAW264.7细胞用无血清的RPMI?1640培养基洗涤1次，然后各加入1×106个/ml HL60细胞悬液5ml，共培养24h，取上述各组中的HL60细胞悬液100μl分别加入96孔板的孔内（1×105个/孔），以未经过任何处理的HL60细胞（1×105个/孔）为对照，加入MTT(5mg/ml)10μl，37℃培养4h，加入100μl的裂解缓冲液（25% DMF、10%SDS、2.5%冰醋酸），37℃、5%CO2孵箱中孵育10min，紫色结晶完全溶解后，用酶标仪检测各组细胞的570nm吸光度（A）值。
1.6 共培养HL60细胞bcl?2、bax蛋白的检测
RAW264.7细胞经LPS和IFN?γ处理一定时间后，各加入1×106个/ml HL60细胞悬液5ml，共培养24h，收集各组共培养HL60细胞，4℃ 1 000r/min离心5min，加入细胞裂解液100μl，置-20℃过夜。取冻融细胞于4℃ 15 000r/min离心20min，取上清液用Bradford方法测定蛋白浓度。取总蛋白40μg、以10%SDS?PAGE凝胶电泳分离，电转移蛋白至PVDF膜，用4%BSA封闭1～2h，加入一抗在室温孵育1h，漂洗去除未结合的一抗，加入二抗在室温孵育1h，漂洗去除未结合的二抗，在暗室中进行化学发光法显影。
1.7 共培养HL60细胞Caspase?3活力测定
以荧光基团标记的寡肽Ac?DEVD?MCA作为Caspase?3底物，采用荧光法测定细胞凋亡过程中Caspase?3活力的变化 [6]。离心收集1.2×107个细胞，加入0.4ml匀浆缓冲液，冰浴匀浆破碎细胞，4℃12 000r/min离心15min后收集上清液，用Bradford法测定蛋白浓度。酶活力测定体系总体积为150μl，含有100μg蛋白提取物，荧光底物DEVD?MCA的浓度为25μmol/L。37℃反应30min后用荧光酶标仪测定寡肽底物降解释放出的荧光物质，激发波长355nm，发射波长460nm。Caspase?3酶活力单位定义为在37℃、底物浓度饱和的条件下每分钟产生1 pmol MCA。
1.8 共培养HL60细胞凋亡分析
RAW264.7细胞经脂LPS和IFN?γ处理一定时间后，各加入1×106个/ml HL60细胞悬液5ml，共培养24h，收集各组共培养HL60细胞，细胞用80%乙醇悬浮，置4℃固定24h。取固定后的细胞用生理盐水洗涤2次后，加入RNase A至终浓度50μg/ml，37℃恒温水浴1h，加入PI染液至终浓度为25μg/ml，摇匀后经尼龙网过滤，在FACS420型流式细胞仪上记数10 000个细胞，测定凋亡细胞所占比例。同时通过透射电镜（TEM）观察细胞超微结构并照相。
1.9 共培养HL60细胞DNA片段分析
RAW264.7细胞经脂LPS和IFN?γ处理一定时间后，各加入1×106个/ml HL60细胞悬液5ml，共培养24h，分别收集各组HL60细胞，加入细胞裂解液，置37℃水浴24h，4℃13 000r/min离心15min，弃上清液，滤干，加适量TE溶解，加RNase A（终浓度为100μg/ml），37℃水浴2h，加乙醇沉淀DNA，离心，弃上清液，滤干，加50μl TE溶解，1.8%琼脂糖凝胶电泳，在UVP凝胶成像系统进行摄影。
1.10 统计学处理
实验数据以±s表示，采用SPSS11.0软件用t检验对数据进行统计分析，P＜0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 L?NNA可抑制RAW264.7细胞产生NO
应用ESR自旋捕集技术测定了L?NNA（一种NOS的竞争性抑制剂）对LPS和IFN?γ诱导的NO生成的影响。RAW264.7细胞经LPS和IFN?γ处理24h后，产生了大量NO，用ESR波谱仪可以检测到典型的 [ON?Fe2+(DETC)2] ESR三重峰信号。L?NNA能抑制RAW264.7细胞产生NO，经过400μmol/L L?NNA处理的细胞其(DETC)2?Fe2+?NO自旋加合物的信号强度减少为LPS组细胞的(71.4±6.8) %，见图1。
2.2 L?NNA对RAW264.7细胞iNOS基因表达的影响
采用RT?PCR分析从mRNA水平研究了L?NNA对RAW264.7细胞iNOS基因表达的影响。RAW264.7细胞经LPS和IFN?γ的处理后，iNOS mRNA的表达量大大增加。在加入LPS和IFN?γ处理同时加入L?NNA不影响iNOS基因的转录，见图2。
2.3 内源性NO对HL60细胞的毒性作用
MTT比色原理是利用活细胞线粒体脱氢酶能将MTT盐还原成蓝紫色的甲臢颗粒，以颗粒溶解后呈现的颜色深浅反映细胞活性。HL60细胞与诱导后的RAW264.7细胞共培养12h，由于诱导后的RAW264.7细胞产生大量的NO，导致共培养的HL60细胞存活率降低，使MTT盐还原成蓝紫色的甲臢减少。以未经过任何处理的HL60细胞存活率为100%，其他组细胞存活率见，见表1。表1 内源性NO对共培养HL60细胞存活率的影响（略）注：n=6、±s、与对照组比较，*P＜0.05；与LPS组比较，**P＜0.05
2.4 内源性NO对HL60细胞bcl?2、bax蛋白表达的影响
用蛋白质印迹分析检测HL60细胞中bcl?2、bax蛋白表达水平，可观察到与WAR264.7细胞共培养的HL60细胞bcl?2蛋白水平下降，bax蛋白水平增高，bcl?2/bax比例相应下降,见图3。
2.5 内源性NO激活HL60细胞Caspase?3信号通路
Caspase?3的活化是细胞凋亡的典型特征之一，通过荧光法测定了HL60细胞与诱导24h、12h、6h、3h、0h的RAW264.7细胞共培养后细胞胞浆中Caspase?3的活力，HL60细胞与RAW264.7细胞共培养12h后胞浆中Caspase?3的活力大幅度上升，L-NNA能抑制iNOS活力，减少NO的生成，从而显著降低胞浆中Caspase?3的活化，见图4。
2.6 内源性NO诱导HL60细胞凋亡
细胞发生凋亡以后，活化的核酸内切酶将染色质DNA切割成许多小的片段，这些小片段由于分子量低，可从细胞中扩散出去，使细胞内的DNA含量减少。经PI染色后采用流式细胞术检测细胞内DNA含量，可见在正常细胞G1峰前出现一个DNA含量减少的“G1亚峰”见图5，该峰的出现被认为是细胞发生凋亡的重要标志之一。经机分析，凋亡细胞所占比例对照组为3.1%，LPS组诱导24h为25.3%，LPS＋L-NNA组诱导24h为14.8%。透射电镜观察显示，与RAW264.7细胞共培养的HL60细胞发生了染色质浓缩、沿核周边分布、形成凋亡小体，呈现典型的凋亡细胞形态,见图6B。
2.7 内源性NO使HL60细胞DNA降解
细胞凋亡的一个典型特征就是核DNA降解。活化的核酸内切酶可将DNA降解为大约以200个bp为基数的片段。对DNA进行琼脂糖凝胶电泳后，可显示出梯状电泳条带, 见图7。
3 讨论
过量的NO可导致细胞损伤，NO通过氧化应激机制与超氧阴离子（O2·－）形成过氧化亚硝基阴离子（ONOO－），消耗细胞内的抗氧化物质，如还原型谷胱甘肽，使DNA 发生碱基突变和氧化损伤，使蛋白质中的巯基氧化、脂质过氧化，从而破坏线粒体的结构完整性，导致线粒体PT孔道的开放。体外实验证实，NO可诱导细胞凋亡，而且与NO有量效关系 [7] 。本研究以LPS和INF?γ诱导RAW264.7细胞过度活化为实验模型，观察活化的RAW264.7细胞产生的NO对共培养HL60细胞的损伤作用，通过 MTT实验、流式细胞术、透射电镜及DNA琼脂糖凝胶电泳等方法证实，活化的RAW264.7细胞所产生的NO 可导致共培养HL60细胞凋亡，这种效应可明显地受NOS抑制剂L?NNA的抑制。
线粒体调控细胞凋亡与bcl?2基因家族密切相关。bcl?2和bax是bcl?2 家族中最主要的两个成员，分别具有抑制和促进细胞凋亡的作用，其彼此间的比例决定了细胞的生存和死亡。研究发现，bcl?2定位于线粒体外膜称为PT 孔的线粒体通透性转运孔道，而bax 则散布在基质中，呈可溶性。外源性或内源性的刺激因子作用于细胞线粒体时，bax可促进PT孔开放，释放细胞色素C，与凋亡蛋白酶激活因子1 (Apaf?1)结合，启动Apaf?1→Caspase?9→Caspase?3级联反应，诱导细胞凋亡，而bcl?2可抑制PT孔的开放 [8] 。NO在一定程度上可通过开放PT 孔，释放细胞色素C，激活Caspse?3 而导致细胞凋亡 [9,10] 。本研究结果表明，在活化的RAW264.7细胞产生的NO诱导HL60细胞凋亡的过程中，反映线粒体膜通透性增加，线粒体膜上的bcl?2和bax蛋白的表达发生变化。bcl?2表达明显下降，而bax表达增加， bcl?2与bax比值间的变化与细胞凋亡呈同步关系，提示NO诱导HL60细胞凋亡的途径之一是作用于线粒体，通过bcl?2和bax基因蛋白的表达，调控细胞凋亡。NO引起线粒体结构和功能改变的上游机制可能与氧化剂应激有关。
综合本实验结果，在免疫防御过程中，活化的巨噬细胞可通过产生超氧阴离子和一氧化氮来杀伤病原体和肿瘤细胞。了解巨噬细胞产生和释放超氧阴离子、一氧化氮的分子机制，有利于认识巨噬细胞杀伤入侵病原体和肿瘤细胞的免疫机制，有利于寻找一些方法防止这一过程中超氧阴离子、一氧化氮及其衍生物对正常细胞和组织的损伤，对于预防和过量NO引起的疾病具有一定的指导意义。
【】
［1］Hibbs JB Jr, Taintor RR, Vavrin Z, et al. Nitric oxide: a cytotoxic activated macrophage effector molecule [J]. Biochem Biophys Res Commun， 1988, 157(1): 87?94.
[2] Juliet PA, Hayashi T, Iguchi A, et al. Concomitant production of nitric oxide and superoxide in human macrophages [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2003, 310(2):367?370.
[3]Brune B, Zhou J, Von Knethen A. Nitric oxide, oxidative stress, and apoptosis [J]. Kidney Int Suppl, 2003, (84): S22?24.
[4] Brown GC, Borutaite V. Nitric oxide, mitochondria, and cell death [J] . IUBMB Life, 2001, 52 (3?5): 189?195.
[5] El?Mahmoudy A, Matsuyama H, Borgan MA, et al. Thymoquinone suppresses expression of inducible nitric oxide synthase in rat macrophages [J]. Int Immunopharmacol, 2002, 2(11): 1603?1611.
[6] Dare E, Tofighi R, Vettori MV, et al. Styrene 7,8?oxide induces caspase activation and regular DNA fragmentation in neuronal cells [J]. Brain Res, 2002, 933(1): 12?22.
[7] Chan SH, Wu KL, Wang LL, et al. Nitric oxide? and superoxide?dependent mitochondrial signaling in endotoxin?induced apoptosis in the rostral ventrolateral medulla of rats [J]. Free Radic Biol Med, 2005, 39(5):603?618.
[8] Sharpe JC, Arnoult D, Youle RJ. Control of mitochondrial permeability by Bcl?2 family members [J]. Biochim Biophys Acta， 2004, 1644(2?3):107?113.
[9]Vieira H, Kroemer G. Mitochondria as targets of apoptosis regulation by nitric oxide [J]. IUBMB Life， 2003,55(10?11):613?616.
[10] Yung HW, Bal?Price AK, Brown GC, et al. Nitric oxide?induced cell death of cerebrocortical murine astrocytes is mediated through p53? and Bax?dependent pathways [J]. J Neurochem, 2004, 89(4):812?821.
