TRAIL、NF?κB和Caspase?3在大肠癌中的表达及意义

        作者：罗玉贤，王凤安，闫庆辉，刘津，张国建，蔡建辉，薛平

【摘要】  目的 研究TRAIL、NF?κB和Caspase?3在大肠癌中的表达及意义，探讨NF?κB和Caspase?3的表达对TRAIL抗癌作用的影响。方法 采用免疫组化SP法检测42例大肠癌及其癌旁5cm组织、25例正常大肠粘膜组织中TRAIL、NF?κB和Caspase?3蛋白的表达水平。结果 TRAIL和 Caspase?3在大肠癌、癌旁组织及正常大肠粘膜组织中的表达呈递增趋势，而NF?κB的表达则与之相反（P<0.05）；TRAIL和Caspase?3在中、低分化癌中的表达明显低于高分化癌中的表达，而NF?κB的表达则与之相反（P<0.05）；TRAIL与NF?κB和Caspase?3在大肠癌中的表达均显著相关（P<0.05）。结论 TRAIL、NF?κB和Caspase?3可能与大肠癌的发生、密切相关；抑制NF?κB表达及促进Caspase?3的表达，有可能提高肿瘤细胞对TRAIL的敏感性。

【关键词】  TRAIL；NF?κB；Caspase?3；结直肠肿瘤；免疫组织化学

　　Abstract：Objective  To study the expression and significance of TRAIL(TNF?related apoptosis inducing ligand), Caspase?3 and NF?κB in colorectal carcinoma and investigate the effect of Caspase?3 and NF?κB on the anti?tumor activity of TRAIL. Methods  SP immunohistochemical technique was used to examine the expression of TRAIL, Caspase?3 and NF?κB in 42 cases of colorectal carcinoma and the surrounding tissues of 5cm distance and 25 cases of normal colorectal mucosa. Results  The expression of TRAIL and Caspase?3 was increased from colorectal carcinoma, surrounding tissues to normal colorectal mucosa while NF?κB was opposite（P<0.05）. The expression of TRAIL and Caspase?3 was lower in moderate and poor differentiation degree than those in high differentiation degree, while NF?κB was opposite（P<0.05）. The expression of TRAIL was significant correlated to those of NF?κB and Caspase?3(P<0.05). Conclusion  TRAIL, Caspase?3 and NF?κB may be closely correlated to the occurrence and the development of colorectal carcinoma. Depress the expression of NF?κB and inspire the expression of Caspase?3 may promote the sensitivity of anti?tumor effect of TRAIL.

　　Key words：TRAIL； NF?κB；Caspase?3；Colorectal neoplas；Immunohistochemistry

　　0  引言

    肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 [1]（TNF?related apoptosis?inducing ligand, TRAIL）是Wiley等发现的TNF家族的新成员，具有选择性诱导肿瘤细胞发生凋亡的作用 。由于TRAIL独特的生物学特性而引起了广大学者的关注。但是随着研究的深入，人们发现许多肿瘤对TRAIL并不敏感。NF?κB和Caspase?3是TRAIL诱导细凋亡通路中两个关键性的影响因子，我们通过它们在大肠癌中表达的研究来探讨提高肿瘤对TRAIL敏感性的可能途径。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

    42例大肠癌及距肿瘤边缘5cm癌旁组织取自河北医科大学第二2002～2004年间经手术切除的大肠癌组织标本并经HE染色病理证实，同时以25例外伤等原因所取大肠粘膜组织为正常对照。鼠抗人TRAIL、NF?κB单克隆抗体购于美国Santa Cruz公司；兔抗人Caspase?3多克隆抗体购于美国NeoMarkers公司；鼠及兔SPN免疫组化试剂盒、DAB试剂盒购于美国ZYMED公司。

　　1.2  方法

    采用免疫组化SP法染色，步骤严格按试剂盒说明操作。一抗工作浓度TRAIL为1：50， NF?κB和Caspase?3均为1：100。以PBS代替一抗作为空白对照。

　　1.3  结果判定

    免疫组化根据染色反应的深度及阳性细胞的数量分别记分为0～3分，其中染色深度以多数细胞的呈色反应为准。浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分，不着色为0分。阳性细胞数≤10%为0分，11%～45%为1分，46%～70%为2分，>70%为3分，并根据这两项指标的积分数分为4级，即阴性(-)为0分，弱阳性(+)为2分，阳性(++)为3～4分,强阳性(+++)为5～6分。采用Olyumpus BX51型光学显微镜观察并摄片。

　　1.4  统计学处理 

　　采用SPSS11.0统计软件进行χ2、校正χ2检验及Fisher确切概率法检验。

　　2  结果

　　2.1  TRAIL、NF?κB和Caspase?3在大肠癌、癌旁5cm组织及正常大肠组织中的表达

    TRAIL、NF?κB和Caspase?3免疫阳性产物均为棕黄色，定位于胞浆或胞膜，而NF?κB则定位于胞核，见图1～3。TRAIL和 Caspase?3在大肠癌、癌旁组织及正常大肠粘膜组织中的表达呈递增趋势（P<0.05），而NF?κB的表达则与之相反（P<0.05），见表1。表1  TRAIL、NF?κB和Caspase?3在大肠癌、癌旁5cm组织及正常大肠组织中的表达（略）

　　2.2  TRAIL、NF?κB和Caspase?3在大肠癌中的表达及其与临床病理因素的关系

    TRAIL和Caspase?3在中、低分化癌中的表达明显低于高分化癌中的表达，而NF?κB的表达则与之相反（P<0.05）；TRAIL、NF?κB和Caspase?3的表达与肿瘤的病理类型、淋巴结转移与否及Duke′s分期等因素无关（P>0.05），见表2。表3  TRAIL、NF?κB和Caspase?3在大肠癌中表达的关系（略）

　　2.3  TRAIL与NF?κB和Caspase?3在大肠癌中表达的关系

    为探讨TRAIL对肿瘤细胞敏感性的可能影响因素，我们检验了以上TRAIL诱导凋亡通路中几个关键性的影响因子，统计分析表明，TRAIL与NF?κB和Caspase?3在大肠癌中的表达均显著相关（P<0.05），见表3。表2  TRAIL、NF?κB和Caspase?3在大肠癌中的表达及其与临床病理因素的关系（略）

　　3  讨论

    TRAIL属TNF超家族成员，被称为继FasL、TNF之后第三个死亡因子。TRAIL仅诱导转化细胞、肿瘤细胞和病毒感染细胞发生凋亡，而使正常细胞逃逸其杀伤作用 [1] 。虽然TRAIL可以诱导多数肿瘤细胞凋亡，而且对大多数正常细胞无影响，这一特殊的选择性使TRAIL有可能成为一种新的有效肿瘤药物，但是不同的肿瘤甚至同一肿瘤不同的细胞系对TRAIL诱导的凋亡存在较大差异，这种区别不能完全用“诱骗受体”的调节进行解释 [2，3]。目前的研究表明，TRAIL通过两条不同的信号通路调控凋亡，其一是通过Caspase通路传导凋亡信号，其二是通过活化NF?κB进行基因诱导调控凋亡。Caspase?3 [4]是Caspase通路中与细胞凋亡关系最密切和必须的Caspase分子，具有剪切管家蛋白和DNA片段的功能。作为TRAIL调控凋亡另一重要途径的关键因子，NF?κB是一类广泛存在于细胞中的多显性核转录因子，与肿瘤细胞的生长、增殖和浸润、转移关系密切，还能调控肿瘤细胞的凋亡和免疫活性。NF?κB在被TRAIL激活的同时又可进一步拮抗细胞凋亡，对于维持生物体自身平衡和稳定有重要意义 [5]。

    TRAIL在大肠癌组织中的表达情况在一定程度上可以反映其生物学效能。本组研究中，TRAIL在大肠癌、癌旁组织及正常大肠粘膜组织中的表达呈递增趋势，提示大肠癌发生过程中存在TRAIL的丢失，可能由此造成TRAIL与其死亡受体结合所诱导的凋亡减少，从而促进了大肠癌的发生、，提示TRAIL与大肠癌的发生发展有关。TRAIL在不同分化程度的癌组织中表达有差异，中、低分化癌中的表达明显低于高分化癌中的表达。这表明TRAIL可能是肿瘤分化差的标志，肿瘤在其进展过程中存在某种免疫逃逸机制，通过下调TRAIL的表达而逃避其诱导的凋亡。

    NF?κB在大肠癌中高表达且在中、低分化癌中的表达明显高于高分化癌中的表达，说明NF?κB的表达强度影响肿瘤的恶性程度及发展趋势，可在一定程度上提示大肠癌的预后。Caspase?3在大肠癌中的表达强度随组织分化程度增高而增强，表明Caspase?3在癌组织中通过促进癌细胞凋亡而使恶性程度降低；从另一个角度看，Caspase?3是正常分化细胞所具有的，正常细胞向癌细胞转化的过程中易失去某些表型，因而有理由认为Caspase?3随着分化降低而表达减少，是肿瘤异常分化的结果。

    TRAIL的表达与NF?κB和Caspase?3的表达有明显的相关性。进一步研究发现，TRAIL低表达的大肠癌组织中存在NF?κB表达的增高，说明NF?κB在TRAIL诱导的凋亡通路中作用明显，并有可能是正常组织逃避TRAIL诱导凋亡的机制之一。TRAIL阳性的大肠癌组织中Caspase?3表达也有一定程度的增高，提示Caspase?3的活化不完全取决于TRAIL的表达，可能是多种因素作用的结果。推测TRAIL不直接作用于Caspase?3，需通过受体途径和（或）线粒体途径才能活化Caspase?3，且Caspase?3处于Caspase级联反应的下游区，影响因素众多。此外，Caspase?3也受到一些凋亡抑制基因如survivin等的作用而失活。
   
　　由于许多肿瘤细胞株对TRAIL不敏感甚至耐药，单一的TRAIL治疗往往难以取得理想的疗效，许多作者 [6，7]采用联合化疗药等方法来提高肿瘤细胞对TRAIL的敏感性，虽有一定效果，但距临床应用还有较大差距。通过本次研究，我们发现，大肠癌中存在NF?κB表达上调，Caspase?3表达下调，而TRAIL在癌组织中表达有丢失，这几种因素的共同作用导致了TRAIL对肿瘤细胞诱导凋亡的耐受。作为TRAIL诱导细胞凋亡通路中两个关键性的影响因子，通过抑制NF?κB的活性和提升Caspase?3的活性，有可能提高肿瘤细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性，从而起到抑制肿瘤细胞生长的作用。目前，我们正采用特异性单克隆抗体技术及相关凋亡实验作进一步深入研究，为TRAIL在临床应用提供可靠的实验基础。

【】
  　　［1］Kim Y, Seol DW.TRAIL, a mighty apoptosis inducer [J]. Mol Cells，2003,15(3): 283?293.

　　 [2] Kim K,Fisher MJ,Xu SQ,et al. Molecular determinats of response to TRAIL in killing of normal and cancer cells [J].Clin Cancer Res,2000,6（2）:335?346.

　　 [3] Chawla?Sarkar M，Bae SI， Reu FJ，et al. Downregulation of Bcl?2， FLIP or IAPs (XIAP and survivin) by siRNAs sensitizes resistant melanoma cells to Apo?2L/TRAIL? induced apoptosis. Cell Death Differ [J]. 2004,11(8):915?923.

　　 [4] Park HJ, Kim YJ, Leem K,et al. Coptis japonica root extract induces apoptosis through caspase3 activation in SNU?668 human gastric cancer cells [J]. Phytother Res，2005,19(3):189?192.

　　 [5] Charalambous MP, Maihofner C, Bhambra U, et al. Upregulation of cyclooxy? genase?2 is a ccompanied by indreased expression of nuclear factor?kappa B and Ikappa B kinase alphain in human colorectal cancer repithclial cells [J].Br J Cancer, 2003,88(10):1598?1604.

　　 [6] 黄涛，吕刚，孙洁，等.TRAIL联合阿霉素的体外抗肿瘤特性 [J].沈阳药科大学学报，2005,22(1):56?58.

　　 [7] Toyota H, Kondo S, Kyo S, Mizuguchi J，et al. Enforced expression of a truncated form of Bax?alpha (tBax) driven by human telomerase reverse transcriptase (hTERT) promoter sensitizes tumor cells to chemotherapeutic agents or tumor necrosis factor?related apoptosis?inducing ligand (TRAIL) [J]. Anticancer Res，2006,26(1): 99?105.