骨唾液酸蛋白的表达对骨肉瘤细胞侵袭转移特性的影响
作者：黄涛，陈安民，郭风劲，张衣北，廖晖
【摘要】 目的 构建人骨唾液酸蛋白（BSP）正反义真核表达载体,研究其对骨肉瘤细胞侵袭转移特性的影响。方法 以PCR的方法扩增人BSP的开放阅读框序列，与载体pIRES2?EGFP相连构成重组正反义表达质粒。以脂质体介导转染入MG?63细胞，通过Western blot检测细胞中蛋白的表达。以重组基底膜侵袭实验和划痕实验测定对骨肉瘤细胞侵袭力的影响。结果 成功构建了人BSP正反义核酸真核表达载体，转染后有效表达hBSP，与对照组相比，正义载体转染后使MG?63细胞中hBSP蛋白表达水平升高，侵袭力增强；反义载体转染后使MG?63细胞中hBSP蛋白表达水平降低，侵袭力受到抑制。结论 BSP表达的改变可能在骨肉瘤的浸润转移过程中起重要作用，BSP表达下调可以抑制骨肉瘤的侵袭能力。
【关键词】 骨唾液酸蛋白基因；基因表达；肿瘤转移；骨肉瘤
Expression of BSP Influence on Behavior of Invasion and Metastasis of Osteosarcoma
Abstract：Objective To construct sense and antisense human bone sialoprotein (BSP) eukaryotic expression vector and observe influence of its expression in human osteosarcoma cell line MG?63 cells about invasion and metastasis of osteosarcoma.Methods An open reading frame of human BSP was amplified by PCR method and was reconstructed into the eukaryotic expressive vector pIRES2?EGFP to construct the hBSP sense or antisense expressive vector .The sense and antisense hBSP eukaryotic expression vector was transfected into MG?63 cells with lipofec tamine.The expression of BSP on the cells was measured by Western blotting.Transwell?chamber methodand scarification was used to evaluate influence of BSP expression on osteosarcoma cell invasion and metastasis.Results The sense and antisense hBSP eukaryotic vector was successfully constructed and transfected. Compared with control cells,expression of BSP increased in the cells by sense hBSP eukaryotic vector transfected and invasive power of these cells is enhance,but expression of BSP decreased in the cells by antisense hBSP eukaryotic vector transfected and invasive power of these cells is been inhabited.Conclusion The change of BSP expression may play an important role in osteosarcoma metastasis.The down?regulation of BSP expression can inhibit abilities of osteosarcoma cell invasion and metastasis.
Key words：Bone sialoprotein gene; Gene expression; Neoplasm metastasis; Osteosarcoma
0 引言
骨唾液酸蛋白(Bone sialoprotein，BSP)是细胞外基质中的一种酸性糖蛋白,其组织分布主要在矿化组织(如骨、牙齿) 和钙化的软骨与骨的交界区 [1,2]。近年来对BSP的研究提示它在肿瘤的生长、浸润和转移，肿瘤新生血管的生成，肿瘤的免疫逃逸中都发挥了重要作用。本实验试图通过反义核酸技术构建携带全长人BSP正反义真核表达载体,并转染骨肉瘤MG?63细胞来探讨正反义BSP蛋白的表达对骨肉瘤细胞侵袭迁移等行为的影响。
1 材料和方法
1．1 主要材料和试剂
人BSP克隆载体pUCm?hBSP由本实验室构建，载体含有hBSP基因的从起始密码子到终止密码子的全长cDNA。MG?63细胞株由武汉大学生命院细胞培养室引入。DH5α菌种，pIRES2?EGFP质粒由本室保存。胶回收试剂盒、质粒抽提纯化试剂盒购于上海华舜生物工程有限公司。PCR产物克隆试剂盒购于上海生工生物工程技术服务有限公司。BamHⅠ、Hind Ⅲ购于Toyobo公司。LipofectAMINETM 2000转染试剂盒购于Invitrogen公司。测序由上海博亚生物技术有限公司完成。兔抗人BSP多克隆抗体购于ALEXIS Biochemicals。Matrigel(人工基底膜胶)，Fn(纤维粘连蛋白)购于BD Labware，Transwell(细胞侵袭小室)购于Coster公司。
1．2 方法
1．2．1 正反义人BSP表达载体的构建
1.2.1.1 设计引物
根据人BSP cDNA的全长序列设计出针对人BSP开放阅读框的反义序列的上下游引物，并分别引入酶切位点BamHⅠ和Hind Ⅲ，而上下游所引入的酶切位点与所构建的pUCm?hBSP序列中的多克隆酶切位点顺序相反。反义引物：上游 5'?GCAAGCTT （Hind Ⅲ）GCCAGAGGAAGCAATCAC?3'，下游 5'?GCGGATCC （BamHⅠ）CTTCACTGGTGGTGGTAG?3'。
1.2.1.2 正义人BSP表达载体的构建
pUCm?hBSP与pIRES2?EGFP分别用BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切, 回收插入片段和pIRES2?EGFP线性片段，T4连接酶连接，构成含人BSP的正义真核表达质粒。
1.2.1.3 反义人BSP表达载体的构建
以所构建的pUCm?hBSP克隆载体为模板，用所设计的反义引物进行PCR扩增，产物行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定、回收, 通过T 4连接酶将PCR产物克隆到pUCm?T克隆载体中。再通过BamHⅠ、Hind Ⅲ双酶切，将所获得的反义hBSP片段亚克隆到pIRES2?EGFP表达载体上，从而构成含人BSP的反义真核表达载体。
1.2.1.4 正反义人BSP表达载体的鉴定
产物分别转化感受态细菌DH5α，挑选阳性克隆、扩增、 抽提质粒DNA。经BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切鉴定和DNA测序鉴定。
1．2．2 细胞培养和转染
人骨肉瘤细胞MG?63,按常规方法培养。将细胞共分4组：正义转染组（s?hBSP?MG）、反义转染组（as?hBSP?MG）、阳性对照组(Positive control)即空质粒转染组、阴性对照组（Negative control）即未处理瘤细胞组。转染试剂为阳离子脂质体LipofectAMINETM2000,具体方法按说明书进行。
1．2．3 Western?blot检测各组转染细胞骨唾液酸蛋白的表达
转染后，将4组细胞分别提取总蛋白50μg经10%SDS?PAGE凝胶电泳后,转移至硝酸纤维素膜上, 1%脱脂牛奶室温封闭过夜,加入兔抗人BSP多克隆抗体，37℃下杂交2h，相应二抗室温杂交1h，最后经显色反应并曝光于X线胶片上。
1．2．4 肿瘤重组基底膜侵袭实验
用50mg/L Matrigel 1∶8稀释液包被Transwell小室底部，将Transwell小室放入24孔培养板中，在小室外加趋化因子200μl和含10%FBS的DMEM200μl；在小室内加入100μl肿瘤细胞悬液，细胞数为1×105，每组重复6个样本。常规培养24h后，用棉签小心擦去微孔膜上层细胞，95％乙醇固定，Giemsa溶液染色。在倒置显微镜下计数移至微孔膜下层的细胞，每个样本计数10个视野。
1．2．5 细胞划痕实验
将各组细胞分别接种在用FN预包被的24孔培养板中,每组6孔，每孔细胞数为5×105,常规培养至形成细胞单层，用移液器滴头沿培养板底部划“一”字形横线伤口，继续用无血清DMEM培养。镜下观察12h、24h、36h、48h、60h、72h的细胞运动情况，记录从迁移起点到迁移最远端细胞核之间的距离，用迁移距离反映迁移速度。
1．2．6 统计学处理
实验数据采用SPSS12.0统计软件进行统计学处理，数据用±s表示，差异的显著性用组间t检验，统计方法采用方差分析。P＜0.05有统计学意义。
2 结果
2．1 正反义人BSP表达载体的构建和鉴定
重组正反义人BSP真核克隆质粒经BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切后,1%琼脂糖凝胶电泳, 所得酶切片段约为950bp，与预计大小相同。将所得片断亚克隆至pIRES2?EGFP的相应酶切位点，构建hBSP正反义表达载体。对所得载体再次经BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切鉴定，结果均可得到1条约950bp的目的片断。对重组质粒中BSP开放阅读框片段进行DNA序列测定,与GenBank hBSP进行同源序列比较, 序列组成相同, 正反义序列方向相反，表明正反义重组载体构建成功，见图1。
2．2 细胞转染结果
转染后24h、48h及72h分别在荧光显微镜下观察,未转染细胞在荧光显微镜下观察未见荧光,而转染细胞在荧光显微镜下观察见绿色荧光,且转染后48h表达绿色荧光蛋白的细胞数量多于24h，72h的转染细胞增加量逐渐减少。
2．3 Western blot检测各组稳定转染细胞BSP蛋白的表达
Western blot检测结果表明,各组细胞中均有BSP蛋白的表达, 说明在骨肉瘤细胞中有BSP的表达，和报道一致。但各组表达强度不同,与阴性对照组相比,正义转染组细胞中BSP的表达量增加,反义转染组细胞中BSP的表达量明显降低,阳性对照组细胞中BSP的表达量无变化,见图2。
2．4 重组基底膜侵袭抑制
4组细胞均能够穿过铺有Matrigel的滤膜。和阴性对照组细胞相比，正义转染组肿瘤细胞的穿膜细胞数增高，有显著差异性（P<0.05）。反义转染组的穿膜细胞数明显小于阴性对照组，有非常显著差异性（P<0.01）。阳性对照组和阴性对照组的穿膜细胞数相比无显著性差异(P>0.05),见表1。 表1 Transwell侵袭小室测定各组细胞侵袭能力(略)
划痕后12h，各组细胞均见细胞向远离划痕区回缩，各组分别记录划痕区两侧细胞之间的距离，并以之为基准。24h镜下可见各组少量细胞开始爬行。36h镜下可见细胞向划痕区爬行，反义转染组明显慢于其他各组，而正义转染组、阳性对照组、阴性对照组爬行速度似乎未见明显差异。48h后反义转染组有少数细胞接近划痕区，其余各组均有多量细胞接近划痕区。60h镜下见正义转染组，阳性对照组和阴性对照组划痕区内有少量细胞存在，反义转染组细胞仍在划痕区边缘，划痕内未见细胞存在。72h观察可见正义转染组，阳性对照组和阴性对照组细胞划痕区内有多量细胞，反义转染组的划痕区有细胞散在分布。根据细胞迁移情况，选择了60h时细胞迁移距离进行测定，见表2。表2 划痕损伤模型测定细胞迁移距离(略)
3 讨论
反义核酸技术是肿瘤生物的策略之一，采用设计恰当的反义寡核苷酸能特异性抑制基因表达，极有可能成为治疗肿瘤的新方法。侵袭、转移是恶性肿瘤的本质特征，其转移极其复杂，也是肿瘤临床治疗的难题。因此，应用反义核酸技术控制肿瘤的侵袭转移是目前肿瘤治疗研究的一大热点。Kido等 [3]就通过反义氨肽酶N cDNA转染骨肉瘤细胞,显著抑制骨肉瘤细胞在体外的粘附与移动,并在裸鼠体内有效降低了其肺转移率。
近来有研究表明，许多肿瘤在过程中都伴随有BSP的表达，而这些表达BSP的肿瘤也更容易表现出侵袭、转移的倾向 [4]。Waltregny等 [5]对乳腺癌和前列腺癌研究首次阐明BSP在肿瘤的骨转移中作用显著。Zhang [6] 、Sharp等 [7]证实人乳腺癌细胞在鼠模型中BSP的过度表达能促进骨转移，而抑制了BSP表达的细胞也同时抑制了其骨转移。Oldberg等 [8]研究显示BSP通过其RGD基序促进骨肉瘤细胞之间的粘附。在BSP分子中包括与整合素αvβ3结合的精－甘－天(门)冬氨酸(Arg－Gly－Asp，RGD) 基序，能参与整合素介导的信号传导通路，从而介导细胞的粘附和迁移 [9，10]。由于在正常组织中，BSP的表达仅局限于骨相关细胞和滋养层中，因此我们通过反义核酸技术，构建正反义hBSP表达载体，并选择骨肉瘤细胞作为对象进行转染，初步研究BSP蛋白表达对骨组织自身肿瘤的生物学行为的影响。
实验采用人工基底膜胶和纤维粘连蛋白人工模拟基底膜和细胞外基质，测定转染了正义和反义hBSP的骨肉瘤细胞对基底膜的侵袭和瘤细胞的迁移能力。在侵袭实验中，我们发现，反义转染BSP的肿瘤细胞的迁移能力明显受到抑制。过表达BSP的肿瘤细胞迁移能力得到一定程度的加强，提示BSP水平的上调，可能与骨肉瘤的侵袭转移有密切关系，而BSP水平的下调则能起到抑制骨肉瘤侵袭的作用。说明通过反义hBSP表达载体的转染，直接抑制了DNA的转录而影响到BSP mRNA的表达，使BSP的表达减少，从而降低了瘤细胞的活动和趋向性。在体外划痕实验模型中，也显示反义转染的骨肉瘤细胞的迁移速度受到明显抑制。推测其原理同样是由于BSP的低表达能够抑制FN对瘤细胞运动的趋化作用。
研究结果表明，BSP在骨肉瘤细胞侵袭转移过程中起重要作用，同时也说明脂质体转染BSP cDNA的正、反义核苷酸链对人骨肉瘤细胞的侵袭转移具有一定的影响，表明利用反义hBSP阻断BSP的表达从而抑制骨肉瘤的发生、发展，作为骨肉瘤的基因治疗方法之一是可行的。
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