MAGE?3原核重组表达载体的构建和表达
作者：裴瑞,赵利萍,杨红梅,陈洁,赵国强
【摘要】 目的 构建原核重组表达载体pGEX?4T?1?MAGE?3并检测其在大肠杆菌（E.coli）BL21中的表达。方法 RT?PCR法制备MAGE?3目的基因，采用DNA重组技术将其克隆至pGEM?T Easy和亚克隆至pGEX?4T?1载体，转化E.coli BL21株，经IPTG诱导，12%SDS?PAGE电泳分离和Western Blot表达鉴定。结果 扩增出349bp的MAGE?3目的基因并构建了原核重组表达载体pGEX?4T?1? MAGE?3；测序结果与GenBank收录序列相一致；在E.coli BL21中检测到含该重组表达载体的转化菌表达出分子量约35kD的融合蛋白并证实其为目的蛋白。结论 成功构建的原核重组表达载体pGEX?4T?1? MAGE?3及其所表达的融合蛋白，为以MAGE?3为基础的肽疫苗及特异诊断试剂的研制提供抗原打下了基础，为后续实验提供了依据。
【关键词】 逆转录?聚合酶链反应；黑色素瘤抗原?3；克隆表达；重组蛋白
黑色素瘤抗原?3（melanoma antigen encoding gene?3,MAGE?3）在肿瘤组织中由于具有广泛而且高比例特异性表达的特性，所以，自其被发现以来就引起了人们极大的兴趣。将MAGE?3作为疫苗的免疫疗法是目前研究的热点。研究方向主要集中在MAGE?3基因及其编码的蛋白在肿瘤的检测及免疫方面。用逆转录?聚合酶链反应（RT?PCR）法从mRNA水平可以检测肿瘤抗原的表达。但mRNA水平的基因转录并不等于蛋白质水平的表达。而只有肿瘤抗原的表达，才可诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对该肿瘤细胞的特异性识别与杀伤。肿瘤抗原与机体免疫应答之间的关系更为密切[1]。MAGE?3蛋白抗原在诱发机体抗肿瘤免疫反应及产生特异性杀伤性T淋巴细胞方面具有明确的作用[2]。基于此，我们以pGEX?4T?1为高效原核表达载体，采用RT?PCR法从肝癌组织制备出MAGE?3目的基因，成功构建了pGEX?4T?1?MAGE?3重组质粒并对此进行了蛋白表达和鉴定。为该抗原蛋白作为肽疫苗和检测诊断试剂用于MAGE?3抗原阳性肿瘤的防治提供了条件。
1 材料与方法
1.1 实验材料
肝癌组织标本取自河南省肿瘤。-80℃保存。pGEM?T Easy克隆载体购自Promega公司；pGEX?4T?1原核表达载体为Pharmacia公司产品。大肠杆菌JM109、大肠杆菌BL21（DE3）由郑州大学基础医学院微免实验室保存。RNA提取试剂盒为Qiagen公司产品； DNA小量纯化试剂盒购自大连宝生物公司；限制性内切酶 BamHⅠ、 EcoRⅠ、 XhoⅡ ，禽源性反转录酶（AMV），dNTP、TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、X?gal（5?溴?4?氯?3?吲哚?β?D?半乳糖苷）、IPTG（异丙基硫代?β?D?半乳糖苷）为Promega公司产品；Marker DL2000、琼脂糖购于上海生物工程公司；兔抗MAGE?3多克隆抗血清（一抗）：为Santa Ctuz公司产品；碱性磷酸酶标记的抗?兔IgG免疫球蛋白（二抗）：购自北京中山生物技术公司；NC膜(硝酸纤维素膜)：购于北京益利精细化学品有限公司，PVDF Western?blot membrane：为Bio?Rad公司产品；Protein Marker为TaKaRa公司产品。
1.2 方法
1.2.1 MAGE?3目的基因的制备 采用RT?PCR法，按照QiagenRNA提取试剂盒操作规程，提取总RNA。取其5μl作为模板，在AMV催化下，常规方法反转录出MAGE?3 cDNA 。PCR扩增所需引物是根据原核表达载体pGEX?4T?1和MAGE?3基因序列NM?005362,用DNAStar软件设计，由上海生工公司合成。
上游引物: P1:5’?CAGGATCCATGCCTCTTGAGCAGAGGAGTC3’（210?231）
下游引物: P2:5’?CCGAATTCCCTACTGAGTGCTGCTTGG3’（542?524）
上述字母下划线处为BamH1、EcoR1的酶切位点。此两位点分别与pGEX?4T?1上相应的多克隆位点相吻合。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性60s，55℃退火60s，72℃延伸120s，35个反应循环，最后一个循环72℃延伸300s。取PCR产物5μl 于1.5%琼脂糖凝胶中电泳，DNA Marker2000为标准判断扩增片段。取PCR产物8μl，通过XhoⅡ进行酶切，电泳鉴定。
1.2.2 目的基因与pGEM?T Easy及pGEX?4T?1的重组 大量扩增PCR产物并以1.5%琼脂糖凝胶电泳分离。参照Vitagene DNA凝胶回收试剂盒操作规程加以回收并与pGEM?T Easy载体连接。转化感受态E.coli JM109。据氨苄青霉素抗性（Amp+）、蓝白筛选实验，以T7/SP6为克隆鉴定引物进行三次PCR扩增鉴定。PCR扩增条件：94℃预变性3min，94℃变性55s，55℃复性55s，72℃延伸1min，扩增35个循环。最后一个循环72℃延伸300s。抽取每种扩增产物5μl电泳鉴定。将原核表达载体pGEX?4T?1转化感受态E.coli JM109，培养扩增转化菌。参照Vitagen日常型质粒DNA小量纯化试剂盒操作规程分别提取、纯化pGEM?T ?MAGE?3重组质粒和pGEX?4T?1载体，用BamH1、EcoR I分别酶切，得到MAGE?3目的片段和具有粘端的pGEX?4T?1载体。按照VitageneDNA凝胶回收试剂盒操作规程分别回收目的片段及双粘pGEX?4T?1载体并将两者连接，转化感受态E.coli BL21，据卡那霉素抗性（Kan+），以T1/T2为特异性引物进行PCR扩增鉴定,条件同上。抽取每种样品及酶切产物各5μl，于1.5%琼脂糖凝胶中电泳。将初步鉴定正确的阳性克隆平板寄送上海生物工程公司进行DNA双向测序，并对测序结果用DNASIS,OMIGA软件与GenBank上公布的MAGE?3相应的基因片段进行同源性比较。
1.2.3 目的基因的原核表达及鉴定 将转化有pGEX?4T?1?MAGE?3的E.coli BL21在1mmol IPTG诱导下分别培养1、2.5、4、6h。然后将未经IPTG诱导的及经不同时间诱导的各样品进行12%SDS?PAGE电泳分离，电转移至NC膜上，再经转印，封闭后，以兔抗MAGE?3多克隆抗体（1∶1000稀释）为一抗，碱性磷酸酶标记的抗兔IgG免疫球蛋白（1∶300稀释）为二抗，鉴定原核重组融合蛋白中目的基因片段的表达。
2 结果
2.1 目的基因扩增、鉴定 经RT?PCR扩增得到349bp的MAGE?3目的基因。由于在MAGE?3基因386位有Xholl酶切位点，扩增产物经XhoⅡ酶切应该得到185bp和164bp两个片段，实际扩增及酶切结果与理论预测完全一致，见图1。
2.2 重组质粒筛选、鉴定 以T7/SP6为克隆鉴定引物，随机挑选白色菌落进行PCR扩增，并电泳鉴定，得到约525bp的片段。以T1/T2为亚克隆鉴定引物，随机挑选转化菌落进行PCR扩增，鉴定得到4个阳性克隆：pGEX?4T?1?MAGE?3。实际结果与预期一致，见图2。
2.3 重组质粒序列分析 DNA测序证实，含重组质粒pGEM?T?MAGE?3和pGEX?4T?1?MAGE?3的阳性克隆内插入的MAGE?3目的片段的碱基组成与GenBank公布的MAGE?3 NM 005362基因相应序列完全一致。
2.4 重组质粒中融合蛋白的诱导表达 经IPTG诱导和12%SDS?PAGE电泳，转化有pGEX?4T?1?MAGE?3的E.coli BL21诱导产物在相对分子量为 35kD处出现一条特异蛋白带，其分子量与预期相同，诱导4h产物最多，见图3。
2.5 融合蛋白的Western?Blot鉴定 融合蛋白与一抗（兔抗MAGE?3多抗血清），二抗（碱性磷酸酶标记的抗兔IgG免疫球蛋白）结合后经酶底物显色，进行Western?blot分析。可见诱导含 pGEX?4T?1?MAGE?3的E.coli BL21上出现35KD特异带，而未诱导的含pGEX?4T?1?MAGE?3的E.coli BL21在相应位置未见该条带，见图4。
3 讨论
肿瘤特异性免疫防治的前提和关键是肿瘤抗原。现已被鉴定的肿瘤抗原约有1600多种[3]。而MAGE?3是最早被发现和报道的肿瘤抗原—MAGE抗原家族的一典型代表，它广泛且高比例的特异性表达于不同类型的多种肿瘤组织中，而在除睾丸和胎盘以外的正常组织却均不表达[4?6]。它在众多被发现的肿瘤抗原中是免疫原性最强和能被免疫细胞识别的肽表位最多的抗原之一。它可以诱导机体产生特异性的CTL细胞，还具有提高肿瘤免疫原性的作用[7]，因而在肿瘤免疫防治方面具有重要的潜在价值[8]。例如：可以它为基础进行具有广谱性的预防接种，而这对于那些通过基因和家族史被认为是肿瘤的高发人群来说非常重要[9]。再如：以它为基础制备的疫苗可激活表达该抗原、但发病早期浓度却较低的肿瘤患者的免疫细胞，从而可避免免疫逃逸的发生。还有，可将MAGE?3基因作为检测肿瘤是否有微转移的一种肿瘤标志物，通过RT?PCR对此进行检测，而这将为指导临床、监测疗效、判断预后提供重要资料[10]。另外，以MAGE?3基因为基础构建的载体所表达出的相应蛋白，可用于检测那些体内会自发产生抗MAGE?3抗体的肿瘤患者，而这对于肿瘤的早诊、早治有重要意义。
肽疫苗具有诱导免疫反应的针对性强、易制备、安全、且副作用少等特点，因而吸引了众多国内外学者的注意。他们利用MAGE?3抗原制备的肽疫苗进行了大量的体内外实验[11?15]，并取得了令人欣喜的成果。然而该类疫苗的总体效果仍不尽如人意。例如：有效率不够、抗原性有待提高、体内诱导活性较弱等等。对此，本研究采取了相应措施加以改进。首先，通过软件分析，选择了MAGE?3基因中抗原表位较丰富、编码产物易被MHC分子识别且有利于抗原提呈、能有效激活CTLs的这样一段片段作为目的基因；其次，选择了灵敏且特异性较强的RT?PCR方法；第三,选择了能稳定、高效表达且所表达的目的蛋白易被分离、鉴定、纯化的pGEX?4T?1作为原核表达载体来构建了原核重组表达质粒pGEX?4T?1?MAGE?3，并在IPTG的诱导下，在相应的转化菌中表达出相应的融合蛋白，再经Western?blot检测，以确保所表达目的蛋白的准确无误。从而为研制以MAGE?3为基础的肽疫苗及特异诊断试剂提供抗原打下了基础。
相信利用该抗原所制备的肽疫苗及特异诊断试剂，能在相应的肿瘤免疫防治中取得好的疗效，也期望能在共享该抗原的其它肿瘤组织中发挥防治作用。
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