食管鳞癌组织芯片中MTA1蛋白表达的免疫组织化学研究

           作者：钱海利，李云峰，于静，宋崇文，吕宁，张雪燕，梁萧，付明，林晨

【摘要】  目的 研究食管鳞癌组织中转移相关基因MTA1蛋白定位及表达水平的改变及与食管鳞癌进展、转移的关系。方法 应用食管鳞癌组织芯片通过免疫组织化学染色研究MTA1蛋白在食管癌中的表达情况。结果 MTA1蛋白在食管鳞癌组织中主要定位于胞核，在淋巴结转移灶中出现胞浆与胞核同时着色。正常组织与重度不典型增生、原位癌及癌组织之间差异有统计学意义，在食管鳞癌不同进展阶段的组织中MTA1表达逐渐升高，并且出现异位表达。结论 MTA1与食管鳞癌的侵袭和转移高度相关，在食管鳞癌的过程中可能发挥着重要作用，可作为判断食管癌侵袭及转移能力的辅助因子。

【关键词】  食管鳞癌；MTA1；转移；组织芯片

    在肿瘤细胞的生物学特征中，以侵袭性和转移性最为关键，也是恶性肿瘤的最重要标志，因此，对肿瘤转移机制及方法的研究显得十分迫切。

    MTA1是一个在肿瘤转移过程中表达上调的基因。它是Toh等用差异cDNA文库扫描技术从高转移大鼠乳腺腺癌细胞系中发现的，随后用同源方法发现了人的同源MTA1基因[1]。该基因产物是核小体重塑与脱乙酰基复合体 (nuclear remodeling and deacetylation complex，NuRD)的成分，通过影响染色质的状态来调控基因转录[2]。Toh等研究还发现，MTA1在食管癌中的表达与其H4组蛋白的脱乙酰基活性相关[3]。经典的抑癌基因如p53、p21和Rb基因都受组蛋白乙酰化的调控[4]。高表达MTA1 mRNA的肿瘤细胞侵袭与淋巴结转移率明显升高。有鉴于此，我们对食管癌中的MTA1蛋白表达进行研究，确定MTA1基因在食管鳞癌中表达情况，以及该表达水平与肿瘤临床行为的相关性，为进一步探讨其在食管癌转移过程中的可能分子机制打下基础。

    1  材料与方法

    1.1  抗体

    羊抗人MTA1多克隆抗体（Santa Cruz，sc?9446）HRP标记羊抗鼠IgG（北京中山生物公司，ZB?2305）

    1.2  食管癌组织芯片临床病理资料

    食管癌组织芯片由医学院肿瘤病理科吕宁教授提供。芯片共包含72例食管鳞癌患者的组织样本，就诊时间为2002～2003年。其中癌旁正常鳞状上皮组织67例，重度不典型增生组织42例，侵袭性癌组织70例，淋巴结转移癌组织20例。

    1.3  免疫组织化学染色步骤

    组织标本石腊包埋切片，常规脱腊至水；0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）进行抗原修复；1∶200稀释一抗，37℃作用1h；生物素标记的二抗IgG，37℃孵育30min；加HRP（辣根酶过氧化物酶）标记的链霉卵白素37℃作用30min；冲洗后DAB显色复染封片。

    1.4  免疫组织化学评分

    1.4.1  MTA1各种组织中的核染色评分标准如[5]所述。最终评分范围为0～12分。我们将最终评分8～12定义为强表达，4～8 为中等表达，0～4为弱表达。

    1.4.2  MTA1蛋白的细胞浆染色按以下标准来进行：（a）阳性，组织中细胞浆着色的细胞数≥20%；（b）阴性，组织中上皮细胞或肿瘤细胞的细胞浆着色数<20%。

    1.5  统计学处理

    实验中的数据分析用SPSS11.0进行分析。食管癌不同发展阶段组织之间以及不同侵袭程度组织之间MTA1表达差异用方差分析进行显著性检验。细胞浆与细胞核MTA1阳性率差异用双侧卡方检验进行显著性分析。P<0.05为差异有统计学意义。

    2  结果

    2.1  不同进展阶段食管鳞状细胞癌的MTA1的表达水平

    组织芯片染色质量满意，见图1。在正常食管鳞状上皮细胞，MTA1蛋白在细胞核中低表达，而在不典型增生细胞中，MTA1表达水平增高。在侵袭性癌细胞与转移癌细胞中，MTA1阳性细胞数量及染色强度均明显增高。在研究的样本中，从正常食管鳞状上皮到侵袭癌细胞，MTA1核表达水平随着肿瘤发生阶段的进展而升高，见图2a～c。 72例正常食管鳞状上皮、不典型增生、侵袭癌和淋巴结转移癌的MTA1表达评分分别为2.93±1.81,6.32±2.72, 8.28±2.43和6.95±2.17。不典型增生细胞、侵袭癌细胞与转移癌细胞细胞中MTA1表达水平均高于食管正常鳞状上皮细胞 (P<0.01)。侵袭癌细胞中MTA1表达水平高于不典型增生细胞，且统计学意义显著 (P<0.01)。转移癌细胞中MTA1核表达水平低于侵袭癌细胞，但统计学意义不显著，见图2c,d。

    2.2  从正常食管鳞状上皮细胞至侵袭癌的进程中，MTA1弱表达的样本比例逐渐降低，而MTA1强表达的样本比例逐渐升高。但在转移灶肿瘤细胞中的表达主要集中于中等表达水平，见表1，图3。数据分析中发现MTA1表达水平在不同临床阶段、病理类型的组织中表达差异性不显著，需进一步扩大样本量来进行分析验证。

    2.4  MTA1在食管鳞癌中的异位表达

    我们注意到食管鳞状细胞癌MTA1蛋白出现了不同程度的细胞浆表达，甚至胞膜表达，见图2e、2f。33%无淋巴结转移的食管鳞癌标本显示了MA1蛋白的胞浆表达(17/50)，而45%的转移癌细胞出现MTA1胞浆表达(13/20) (0.01

    3  讨论

    利用病理存档的标本进行免疫组织化学染色方法检测肿瘤组织中相关基因蛋白产物能回顾性研究现有的病例资料，充分利用病例资源，是肿瘤组织学研究中不可替代的手段。组织芯片技术可以将数十个甚至上千个不同个体的临床组织标本按预先设计的顺序排列在一张玻片进行分析研究，可以按照不同的需求设计组织排列，具有高通量、可比性强、节约大量成本（时间、财力、人力）的优点，而且在同样的条件下进行操作及染色等过程，提高了样本之间蛋白表达水平的可比性，减小了操作的系统误差[6, 7]。利用组织芯片能同时对几百甚至上千种正常或疾病以及疾病不同阶段的病理生理状态下的组织样本，进行某一个或多个特定的基因或与其相关的表达产物的研究[8]。组织芯片技术可以广泛地与DNA、RNA、蛋白质、抗原、抗体、细胞、传统的病技术、免疫组织化学、原位杂交、原位PCR、原位RT?PCR等技术相结合，分别在基因、转录和表达产物的生物学功能这三个水平上进行研究。组织芯片技术目前已成为各医学实验室及生物芯片公司争相研制的热门技术。

    肿瘤转移造成肿瘤细胞的播散，给肿瘤的手术带来巨大的障碍。因此，深入了解肿瘤转移相关因子的变化可特异反映侵袭转移的能力，不仅可以作为判断肿瘤恶性转移的预测指标，并且有助于诊断和采取合适的治疗手段。在本研究中，采用了组织芯片的免疫组织化学研究确定MTA1在食管癌组织中的表达情况，拟为食管癌的治疗及预后提供分子水平的指标。

    随着食管上皮组织向癌组织的进展，MTA1蛋白的表达水平升高，依次为侵袭癌组织＞重度不典型增生组织＞癌旁正常组织，差别有统计学意义。表明随着食管鳞癌的发生与发展，MTA1蛋白的表达水平发生了改变。在浸润癌组织中MTA1蛋白具有最高的表达水平，淋巴结组织中的MTA1表达水平虽然高于癌旁正常组织及重度不典型增生组织，但低于侵袭癌组织。并且随着肿瘤进展，在浸润癌及转移癌灶中MTA1蛋白出现胞浆染色并且有统计学意义。这一现象提示在肿瘤的发生发展过程中MTA1的表达与定位可能发生了紊乱。Moom WS等进行的一项肝细胞癌中MTA1表达的研究中，也发现了MTA1蛋白的胞浆转移[9]。这一现象的具体机制及功能尚不清楚，有待进一步研究。其他研究也显示了MTA1在肺癌、肝癌及前列腺癌中与转移的正相关性[9?11]。随着肿瘤分子生物学研究的进展，MTA1在肿瘤侵袭转移过程中发挥的作用将被进一步揭示。

【参考】
  ［1］ Toh Y, Pencil SD, Nicolson GL. A novel candidate metastasis?associated gene, mta1, differentially expressed in highly metastatic mammary adenocarcinoma cell lines. cDNA cloning, expression, and protein analyses /[J/]. J Biol Chem, 1994,269(37):22958?22963.

/[2/] Nicolson GL, Nawa A, Toh Y, et al. Tumor metastasis?associated human MTA1 gene and its MTA1 protein product: role in epithelial cancer cell invasion, proliferation and nuclear regulation /[J/]. Clin Exp Metastasis, 2003,20(1):19?24.

/[3/] Toh Y, Ohga T, Endo K, et al. Expression of the metastasis?associated MTA1 protein and its relationship to deacetylation of the histone H4 in esophageal squamous cell carcinomas /[J/]. Int J Cancer, 2004,110(3):362?367.

/[4/] Roy S, Packman K, Jeffrey R, et al. Histone deacetylase inhibitors differentially stabilize acetylated p53 and induce cell cycle arrest or apoptosis in prostate cancer cells /[J/]. Cell Death Differ, 2005, 12(5):482?491.

/[5/] Hao XP, Pretlow TG, Rao JS, et al. Beta?catenin expression is altered in human colonic aberrant crypt foci /[J/]. Cancer Res, 2001, 61:8085?8088.

/[6/] Hedvat CV, Hegde A, Chaganti RS, et al. Application of tissue microarray technology to the study of non?Hodgkin's and Hodgkin's lymphoma /[J/]. Hum Pathol, 2002,33(10):968?974.

/[7/] Fernebro E, Bendahl PO, Dictor M, et al. Immunohistochemical patterns in rectal cancer: application of tissue microarray with prognostic correlations /[J/]. Int J Cancer, 2004,111(6):921?928.

/[8/] Dong P, Li X, Zhu Z, et al. Application of tissue microarray: evaluation of the expression of S?100?positive dendritic cells, tumor suppressor gene p63 and tissue inhibitor of metalloproteinase?1 in laryngeal carcinoma /[J/]. Acta Otolaryngol, 2004,124(10):1204?1207.

/[9/] Moon WS, Chang K, Tarnawski AS. Overexpression of metastatic tumor antigen 1 in hepatocellular carcinoma: Relationship to vascular invasion and estrogen receptor?alpha /[J/]. Hum Pathol, 2004,35(4):424?429.

/[10/]Hofer MD, Kuefer R, Varambally S, et al. The role of metastasis?associated protein 1 in prostate cancer progression /[J/]. Cancer Res, 2004,64(3):825?829.

/[11/]Sasaki H, Moriyama S, Nakashima Y, et al. Histone deacetylase 1 mRNA expression in lung cancer /[J/]. Lung Cancer, 2004,46(2):171?178.