HPV18 E6E7反义荧光真核表达载体的构建及其在宫颈癌HeLa细胞中的表达
作者：司马妮，王薇，田训，罗爱月，李春晓，王娟，卢运萍，王世宣，马丁
【摘要】 目的 构建HPV18型E6E7反义荧光真核表达载体，并观察其对宫颈癌HeLa细胞中HPV18 E6和E7基因表达的影响，探索反义技术用于临床HPV感染及宫颈癌的可能性。方法 以HPV18型全基因质粒为模板，PCR法扩增HPV18型E6E7区716bp片段，利用基因重组技术将目的片段反向插入荧光真核表达载体pEGFP?C1，EcoR I酶切并测序鉴定；采用脂转法将重组质粒pEGFP?HPV18E6E7as（EGFP?18AS）转染宫颈癌HeLa细胞株，通过RT?PCR及western blot检测细胞中E6、E7 mRNA和蛋白的表达。结果 成功构建HPV18 E6E7反义荧光真核表达载体EGFP?18AS，经脂质体转染HeLa细胞，48h后在荧光倒置显微镜下可见明显的绿色荧光，且细胞中E6、E7 mRNA及蛋白表达水平均明显下调。结论 反义荧光真核表达载体可以有效的抑制HPV18 E6、E7癌基因的表达，为治疗HPV感染和宫颈癌提供了一种新的方法。
【关键词】 人乳头瘤病毒18型；E6/E7；反义；EGFP；宫颈癌
宫颈癌是妇女常见的恶性肿瘤之一，在全球范围内，其发病率仅次于乳腺癌，但在广大家其发病率居首位，约占女性恶性肿瘤总数的25%[1]。研究表明，99%的宫颈癌组织中可检出人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)，尤其是16、18型等高危型HPV与宫颈癌发生关系密切。现已证实高危型HPV早期蛋白中的E6和E7为宫颈上皮恶性转化中的关键蛋白，因此针对E6、E7基因为靶点的治疗手段成为我们研究的重点。反义技术是近年来兴起的一种基因治疗技术，该技术可以高效、特异的阻断目的基因的表达。因此利用反义技术从基因水平封闭病毒癌基因E6、E7，有望成为宫颈癌基因治疗的有效途径[2]。本研究成功构建了可表达HPV18的E6、E7反义RAN的荧光真核表达载体，经脂质体转染宫颈癌HeLa细胞株，观测其对于HPV18 E6/E7 mRNA及蛋白表达的影响，为临床HPV感染及宫颈癌治疗探索新的方法。
1 材料与方法
1.1 载体、菌株和细胞株 含有HPV18标准全长基因的质粒由德国海德堡大学Ethel?Michele de Villiers教授惠赠。真核表达载体pEGFP?C1购自Clontech公司。HeLa细胞购自美国典型培养物保藏中心（ATCC），大肠杆菌株DH5α由本室保存。
1.2 引物和测序 扩增HPV18E6E7基因片段的引物：P1 5' TAA TCG ATA TAA TCC AAC ACG GCG ACC C 3'，P2 5' GGG ATC GAT GGC TTT CTA CTA CTA GCT CAA T 3'。检测HPV18的E6基因的引物：P1 5' GGC GAC CCT ACA AGC TAC CTG A 3'，P2 5' TTC TCT GCG TCG TTG GAG TCG TTC 3'。检测HPV18的E7基因的引物：P1 5' AAG CGA CTC AGA GGA AGA 3'，P2 5' CAC AAA GGA CAG GGT GTT 3'。内参照β?actin的引物：P1 5'?AGC CAT GTA CGT TGC TAT CC?3'，P2 5'?TTG GCG TAC AGG TCT TTG C?3'。内参照GAPDH的引物：P1 5'?GGA GCC AAA AGG GTC ATC A?3'，P2 5'?GCC ATC ACG CCA CAG TTT C?3'。5个PCR扩增产物长度分别为716、440、199、498、255bp。上述所有引物的合成和测序工作均由上海英骏生物技术有限公司完成。
1.3 主要试剂 RNA提取试剂TRIzol和细胞培养基DMEM购自Gibco公司，Taq DNA聚合酶和T4连接酶为MBI公司产品，Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司，逆转录酶M?MLV购自Promega公司，限制性内切酶EcoR I为TaKaRa公司产品。HPV16/18 E6抗体（sc?460）、HPV18 E7抗体（SC?1590）和β?actin抗体（sc?1616?R）购自Santa Cruz公司。ECL试剂盒购自Pierce公司。
1.4 载体构建和鉴定 以含有HPV18全长基因组的质粒为模板，行PCR扩增HPV18E6E7基因片段，条件如下：95℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 60s，35个循环。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下拍照。PCR产物连接T?载体，蓝白斑筛后EcoR I酶切获得目的片段，然后将其与经EcoR I酶切线性化的pEGFP?C1 16℃连接。连接产物转化DH5α菌株，挑取单克隆，酶切和测序鉴定。将测序为反向构建成功的质粒命名为pEGFP?HPV18E6E7as（EGFP?18AS）。
1.5 细胞培养和转染 用EGFP?18AS和pEGFP（对照质粒）分别经Lipofectamine 2000转染HeLa细胞后继续培养，6～8h后开始在荧光倒置显微镜下观察绿色荧光并评估其转染效率。
1.6 RT?PCR检测 转染后48h分别用TRIzol试剂提取转染EGFP?18AS、pEGFP的SiHa细胞及未处理的SiHa细胞的总RNA，各取2μg mRNA，按照逆转录酶M?MLV说明书进行逆转录，再取等体积cDNA模板，用检测HPV18的E6、E7基因的引物进行RCR扩增，条件如下：95℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 60s，30个循环。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下拍照。同时PCR扩增β?actin或GAPDH作为内参照。
1.7 Western blot检测 在转染后48h分别用三去污法提取上述三组细胞总蛋白，测定浓度后取50μg蛋白上样，用Western blot检测细胞中E6、E7蛋白的表达。具体方法如下：蛋白经SDS?PAGE 60V电泳1.5h后转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，后5%脱脂奶37℃封闭1h，一抗（1∶100）4℃过夜，相应二抗（1∶3000）37℃孵育1h，ECL试剂盒化学发光后曝光成像，同时检测β?actin（1∶500）的表达作为内参照。
2 结果
2.1 HPV18 E6E7基因片段的扩增和EGFP?18AS重组载体的鉴定 从含有HPV18标准全长基因的质粒中扩增目的片段，大小为0.7kb。将重组质粒用EcoR I酶切，获得两条大小为4.7kb和0.7kb的片段，与载体和目的片段吻合。测序证实重组载体中的插入序列与目的基因序列反向匹配。
2.2 HeLa细胞的转染 EGFP?18AS和pEGFP两种质粒转染HeLa细胞后6h在荧光显微镜下可观察到少量绿色荧光，24h表达量明显增加，48h达到高峰。
2.3 转染后48h E6、E7表达的变化 用RT?PCR检测转染前后E6、E7基因的mRNA的变化，见图1。结果显示，EGFP?18AS转染后48h，HeLa细胞中E6、E7基因的mRNA较转染空质粒与未处理细胞显著减少，转染空质粒和未处理细胞间无明显差异。用Western blot检测转染前后E6、E7基因的蛋白的变化，见图2。结果显示，EGFP?18AS转染后48h，HeLa细胞中E6、E7蛋白较转染空质粒和未处理细胞显著减少，转染空质粒细胞与未处理细胞间也无明显差异。
3 讨论
人乳头瘤病毒是一种在人群中广泛流行的双链DNA病毒，具有嗜上皮性，易侵袭皮肤和黏膜。根据其基因组DNA的同源性，HPV可分为110多个型别。在宫颈癌患者的宫颈组织中常可检出HPV，尤其是所谓高危型HPV。现有的流行病学和分子生物学资料证实，高危型HPV的持续感染是导致宫颈癌的主要病因。HPV的致癌机理主要是病毒DNA整合于宿主基因组，异常表达病毒癌基因E6、E7。E6和E7基因分别编码含约180个氨基酸和100个氨基酸的癌蛋白。E6蛋白可以特异地与抑癌基因产物p53结合，经过泛素途径快速诱导抑癌基因p53降解，导致G1期进行DNA损伤修复的生理性停滞被解除；E7蛋白可与抑制基因pRb结合，使pRb高磷酸化失活，释放出原结合于pRb的核转录因子E2F。有研究[3]表明，E6、E7蛋白不仅在上皮细胞的恶性转化中起着重要的作用，对肿瘤的恶性表型的维持也起着最重要的作用。Yoshinouchi等[4]认为E6和E7不仅可以转化人上皮细胞，且表达高危型HPV的宫颈癌细胞株在在阻断E6、E7的情况下可以发生恶性表型的逆转。这些研究结果表明，阻断HPV的E6、E7基因，有可能成为宫颈癌基因的有效途径[5]。
HPV18型是一种高危型HPV，与宫颈腺癌关系密切。Steele[6]的研究表明，封闭HPV18的E6和E7基因将明显减缓HeLa等含HPV18的肿瘤细胞的生长，引起细胞周期阻滞。用HPV18 E6基因的反义RNA[6]和siRNA[7]作用于宫颈癌细胞，HPV18 E6蛋白的表达明显降低，细胞凋亡显著增多。我们在以前的研究中构建了表达HPV16 E7基因反义RNA的腺相关病毒载体[8]，结果表明可以阻断E7?pRb通路，引起细胞周期阻滞，诱导细胞凋亡。考虑到HPV18型的E6和E7由同一条mRNA表达，是一对双顺反子基因[7]，两个基因紧密相邻。本次研究中，我们设计了针对HPV18型的E6、E7基因的反义片段。结果显示，我们构建的真核表达载体可以显著减少HPV18型E6、E7基因的mRNA和蛋白的表达。这些结果表明，HPV18型E6、E7基因的反义RNA可以从mRNA水平上封闭E6、E7基因，减少E6、E7癌蛋白的表达，从而有可能从E6?p53、E7?pRb两条通路上阻断肿瘤细胞的恶性增殖，诱导细胞凋亡。这就为我们利用HPV18型E6、E7基因的反义RNA来治疗HPV感染和预防宫颈癌发生提供了理论依据。
【】
［1］ Burd EM. Human papillomavirus and cervical cancer/[J/]. Clin Microbiol Rev, 2003,16(1):1?17.
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/[4/] Yoshinouchi M, Yamada T, Kizaki M, et al. In vitro and in vivo growth suppression of human papillomavirus 16?positive cervical cancer cells by E6 siRNA/[J/]. Mol Ther, 2003,8(5):762?768.
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/[7/] Yamato K, Fen J, Kobuchi H, et al. Induction of cell death in human papillomavirus 18?positive cervical cancer cells by E6 siRNA/[J/]. Cancer Gene Ther, 2006,13(3):234?241.
/[8/] Wu S, Meng L, Wang S, et al. Reversal of the malignant phenotype of cervical cancer CaSki cells through adeno?associated virus?mediated delivery of HPV16 E7 antisense RNA/[J/]. Clin Cancer Res, 2006,12(7 Pt 1):2032?2037.
