食管癌高表达抗原HLA?A2/A3限制性细胞毒性T淋巴细胞表位预测
作者：孙战强,李永欣,娄慧萍,李静静,陈鲤翔,祁元明
【摘要】 目的 预测食管癌普遍高表达蛋白COX?2和MAGE?4的HLA?A2/A3限制性CTL表位。方法 运用生物信息学的方法，SYFPEITHI初步预测，结合三维构效定量关系和蛋白酶体酶切位点分析。结果 对SYFPEITHI预测＞20的九肽用MHCPred和NetChop3.0作进一步分析，并与已报道抗原肽进行比对，初步筛选出了42个潜在的CTL表位。结论 这42个九肽均未见报道，进一步鉴定将为CTL表位疫苗的研究提供更多的线索。其中，MAGE? 422?30、202?210、286?294及COX?2479?487 4个九肽具有与HLA?A2和HLA?A3超型潜在的交叉免疫活性，将为研制简约的高效广谱食管癌疫苗提供候选肽。
【关键词】 食管癌；HLA；环氧合酶?2；MAGA?4；CTL表位
环氧合酶?2（COX?2）是新近发现在食管癌细胞中高表达的一个蛋白（鳞癌91％、腺癌78%）[1]，尚未见HLA?I类限制性CTL表位肽的报道。MAGE?4在食管癌中的表达远高于MAGE其他家族成员（超过60％），但对其抗原肽的研究还比较少，特别是鲜见以食管癌为靶细胞鉴定新的抗原肽的报道。因此，探索COX?2及MAGE?4抗原的HLA?A2/A3限制性细胞毒性T 淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)表位，以CTL表位为基础的肽疫苗，在食管癌及其他COX?2 & MAGE?4阳性的肿瘤患者的免疫学方面有较好的应用前景。
本研究拟以矩阵法(Matrices)、三维定量构效关系（3D?QSAR）及蛋白酶体酶切位点分析，对COX?2及MAGE?4抗原的HLA?A2/A3限制性CTL表位进行预测从而为临床肽疫苗的研制提供理论基础。
1 材料和方法
1.1 材料
选择在食管癌有高表达的COX?2（604aa）和MAGE?4（317aa）作为目的抗原，氨基酸序列引自GENEBANK。
1.2 方法
1.2.1 SYFPEITHI预测 进入SYFPEITHI在线预测主页（http//www.syfpeithi.de/ scripts/MHCServer.dll/home.htm），点击“Epitope prediction”进入预测界面，选择“HLA?A*0201”及HLA?A*03分别对目的抗原进行表位预测。分值超过20的九肽进一步进行分析。
1.2.2 针对蛋白酶体裂解基序(Proteasomal cleavage motifs)的预测方案(NetChop3.0) 运用NetChop3.0分析工具，以FASTA格式输入目的抗原序列，进行C?端酶切位点分析。
1.2.3 基于结构的表位预测算法（MHCPred） 利用MHCPred预测工具，A2超型锚点P2（AILMVT）、P9（AILMVT），A3超型锚点P2（AILMVST）、P9（RK）。分值＞5.0被认为具有结构亲和性。
2 结果
将所有SYFPEITHI预测值超过20分的九肽进行归纳。其中，HLA?A2限制性表位MAGE?4 15个、COX?2 30个；HLA?A3限制性表位MAGE?4 18个、COX?2 26个；同时与两种基因型有较高预测分值的九肽中，MAGE?4 有3个、COX?2有4个。对SYFPEITHI初步预测结果进行酶切位点分析。其中，HLA?A2限制性表位MAGE?4 12个、COX?2 20个；HLA?A3限制性表位MAGE?4 13个、COX?2 26个；同时与两种基因型有较高预测分值的九肽中，MAGE?4 有3个、COX?2有4个。再进行3D?QSAR分析，其中，HLA?A2限制性表位MAGE?4 12个、COX?2 22个；HLA?A3限制性表位MAGE?4 13个、COX?2 有0个。
从初步预测结果中选择出至少42个九肽可用于进一步研究，其中HLA?A2限制性表位29个，HLA?A3限制性表位9个，另外4个九肽可能是兼具两种HLA超家族的限制性表位，见表1。
3 讨论
研究表明，寻找有效的优势CTL 表位成为肿瘤特异性免疫治疗及治疗性多肽疫苗研究的重要前提。而CTL表位的快速筛选和鉴定是研制基于CTL表位疫苗的关键。
据统计，仅HLA?A2（包括A*0201、A*0202、A*0203、A*0204、A*0205、A*0206、A*0207和A*6802）与HLA?A3 （包括A*0301、 A*1101、A*3101、A*3301和A*6801）两个超型在人中的总平均分布频率就超过85%[2，3]。而同一超型识别的肽序列非常相似。因此，采用相应于几种超型的表位就有可能研制出覆盖大部分人群的肿瘤表位疫苗，克服MHC多态性的障碍，而且，交叉反应性表位肽通常都是免疫优势表位。
X射线晶体衍射揭示[4]：MHC分子口袋A和F位于凹槽两端，其氨基酸组成在不同型别的类分子中高度保守，可与表位肽N端残基和C端残基形成稳定而强大的氢键作用，保证了MHC分子能够识别众多的表位，而肽结合槽中间部分的氨基酸残基，其组成和空间构型具有高度多态性。正是这一结构基础，为不同型别类分子结合多肽的序列进行表位预测提供了理论基础，从而使通过机辅助手段进行CTL表位预测的成为可能。
1991年，Rotzschke等[5]发现与HLA限制性分子结合的抗原肽，在2～3个特定的位点上常出现一种或几种有相似化学性质的氨基酸残基，称之为MHC结合基序(MHC binding motif)或称锚定残基(Anchor residue)。许多研究小组根据结合基序建立了自己的预测算法并相继鉴定了一批CTL表位，从而证明了结合基序法的有效性。之后，出现的大量预测方案，包括频率分析（Frequency analysis)、量化基序(Quantitative motifs)、亲和力矩阵(Affinity matrics)等。矩阵法与简单基序法相比，由于它试图考虑每一种氨基酸在MHC配体特定位点上出现的可能性，故而预测的精度有较大提高。其中SYFPEITHI[6]在线预测尤为得到认可。也有通过人工神经（ANN）进行预测的程序，但可选择表位尚少。无论是结合基序法、矩阵法还是ANN法，其实质都是基于蛋白质一级结构的表位预测方法，因而无法在预测时充分考虑肽?MHC复合物的三维构象。Doytchinova等[7]从表位多肽的结构特征出发，利用三维定量构效关系 (Three?dimensional quantitative structure activity relationship，3D?QSAR) 来研究表位肽结构性质与亲和性之间的关系，通过比较分子相似性指数分析方法( CoMSIA )将静电场、疏水场等理化参数与亲和力进行拟合建立模型，并以交互检验方法验证模型的有效性，最终得到的构效关系模型有较好地预测能力 (q2 = 0.683，r2=0.891)。
以上是基于结构特点的预测，最近，抗原肽递呈加工途径的分析预测日益得到重视，其中包括针对蛋白酶体裂解基序(Proteasomal cleavage motifs)的预测方案和TAP的预测方案。Kesmir等[8] 的NetChop3.0，采用MHC类配体信息和蛋白酶体酶切数表1 HLA?A2/A3限制性表位预测结果
据共同训练一个三层前馈型人工神经网络，使其判断一个蛋白酶体酶切位点达到了很高的精度。本研究首先运用SYFPEITHI对在食管癌组织中有普遍高表达的MAGE?4和COX?2进行HLA? A2/A3限制性预测，再经过三维构效定量关系和蛋白酶体酶切位点分析，初步筛选出了42个潜在的CTL表位。这42个九肽均未见报道，对这些九肽的进一步鉴定将为CTL表位疫苗的研究提供更多的线索。其中，MAGE?422?30、202?210、286?294及COX?2479?4874个九肽具有与HLA?A2和HLA?A3超家族潜在的交叉免疫活性，将为研制简约的高效广谱食管癌疫苗提供候选肽。
【文献】
［1］ Zimmermann KC，Sarbia M， Weber AA，et al. Cyclooxygenase ?2 Expression in Human Esophageal Carcinoma1 /[J/].Cancer Res,1999，59(1): 198?204.
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/[4/] Madden DR. The three?dimensional structure of peptide?MHC complexes /[J/] . Annu Rev Immunol， 1995， 13:587?622.
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/[7/] Doytchinova IA， Flower DR.Physicochemical explanation of peptide binding to HLA–A* 0201 major histocompatibility complex: a three?dimensional quantitative structure?activity relationship study /[J/]. Proteins， 2002， 48(3): 505?518.
/[8/] Kesmir C， Nussbaum AK， Schild H， et al. Prediction of proteasome cleavage motifs by neural networks /[J/]. Protein Eng， 2002，15(4):287?296.
