非小细胞肺癌中survivin、bcl?2和bax蛋白与多药耐药基因的表达及其相关性
【摘要】 目的 检测非小细胞肺癌（NSCLC）中凋亡蛋白survivin、bcl?2、bax与多药耐药有关基因MDR1mRNA和MRPmRNA的表达，探讨其相互关系及意义。方法 选取113例NSCLC病例，采用原位分子杂交检测MDR1和MRP基因mRNA的表达，SP免疫组化法检测survivin、bcl?2、bax蛋白的表达。结果 113例NSCLC中，MDR1mRNA、MRPmRNA及survivin、bcl?2、bax蛋白的检出率分别为51.3%、80.5%、79.6%、59.3%、54.9%。survivin和bax的表达与肿瘤分化程度有关（P＜0.05），bcl?2的表达与肿瘤组织学类型有关（P＜0.01）。MDR1mRNA与MRPmRNA（P＜0.01）、survivin与MDR1mRNA（P＜0.05）、bcl?2与MRPmRNA（P＜0.05）表达之间存在明显相关性。结论 凋亡抑制蛋白survivin的高表达和bcl?2的过表达可能是导致NSCLC原发耐药的重要因素，检测survivin和bcl?2对临床逆转 NSCLC多药耐药性具有指导意义。
【关键词】 肺肿瘤 多药耐药 细胞凋亡 原位杂交 免疫组织化学
0 引言
多药耐药性（multidrug resistance，MDR）是影响非小细胞肺癌（non?small cell lung cancer，NSCLC）化疗效果的主要原因。大量研究表明，多药耐药机制是多因素作用、多基因改变的复杂过程。近年来，除经典的耐药途径外，细胞凋亡抑制与多药耐药的关系日益受到重视。本实验选取了113例未经的NSCLC病例，用原位杂交法检测MDR1和MRPmRNA的表达，SP免疫组化法检测3种凋亡相关蛋白（survivin、bcl?2和bax）的表达，旨在观察NSCLC中多药耐药与细胞凋亡的关系并进一步探讨多药耐药产生的其他机制。
1 资料与方法
1．1 资料
收集武汉大学中南病理科1996～2000年间手术切除并经病理确诊的NSCLC共113例，所有病例术前均未经放化疗。其中男性91例，女性22例。年龄34～77岁，均龄56岁。鳞癌39例，腺癌61例（含细支气管肺泡癌16例），腺鳞癌13例。高分化43例，中分化47例，低分化23例。根据1997年肺癌国际分期修正系统公布的TNM分期标准，Ⅰ期52例，Ⅱ期26例，Ⅲ期11例，Ⅳ期1例，23例无记录。有淋巴结转移者37例，无淋巴结转移者53例，23例无记录。
1．2 方法
1．2．1 HE染色切片用于NSCLC组织学分类及分化程度、转移状态的判断。
1．2．2 原位杂交所用地高辛标记MDR1、MRP寡核苷酸探针及检测试剂盒购于武汉博士德生物公司，其操作按试剂盒说明书进行，以阳性片作阳性对照，PBS代替杂交液作阴性对照。
1．2．3 SP免疫组化染色按试剂盒说明操作，所用兔抗人survivin多克隆抗体、鼠抗人bcl?2和bax单克隆抗体购于福州迈新生物公司，均为即用型。以已知阳性片作阳性对照。PBS代替一抗作阴性对照。
1．3 结果判断
原位杂交染色中MDR1和MRPmRNA以胞浆出现棕黄色颗粒为阳性细胞。免疫组化染色中survivin、bcl?2和bax以胞浆呈棕黄色为阳性细胞。每例取10个高倍视野（×400），每个视野计数100个细胞，阳性细胞所占百分比。阳性细胞数≥5%为阳性表达，＜5%为阴性表达。
1．4 统计学处理
采用SPSS12.0统计软件分析数据，结果采用χ2检验。P＜0.05为显著性检验水准。
2 结果
2．1 NSCLC中MDR1mRNA和MRP mRNA的表达及相互关系
113例NSCLC中，MDR1mRNA阳性表达率为51.3%（58/113），MRPmRNA阳性表达率为80.5%（91/113）。二者表达与肿瘤组织学类型、分化程度、TNM分期和有无淋巴结转移等临床病理因素均无明显关系（P＞0.05），但二者表达之间具有显著相关性（χ2＝13.72，P＜0.01）,见表1。
2．2 3种凋亡相关蛋白的表达及相互关系
2．2．1 113例NSCLC中survivin、bcl?2和bax蛋白的阳性表达率分别为79.6%（90/113）、59.3%（67/113）和54.9%（62/113）。
2．2．2 survivin和bax蛋白的表达与肿瘤细胞分化程度明显相关（χ2＝6.74，P＜0.05；χ2＝16.39，P＜0.01）。survivin表达随着肿瘤分化程度的降低而递增，bax表达则呈相反趋势。2种蛋白表达与肿瘤组织学类型、TNM分期和有无淋巴结转移之间均无明显相关（P＞0.05）。
表1 113例NSCLC中MDR1和MRP mRNA表达之间的关系 （略）
2．2．3 bcl?2蛋白在不同组织学类型肿瘤中的表达顺序依次为鳞癌＞腺鳞癌＞腺癌，差异具有统计学意义（χ2=13.06，P＜0.01）。但bcl?2与肿瘤分化程度、TNM分期和有无淋巴结转移之间差异均无显著性（P＞0.05）。
2．2．4 survivin、bcl?2和bax蛋白三者表达之间未见明显相关（P＞0.05）。
2．3 多药耐药基因与凋亡相关蛋白表达间的关系
2．3．1 survivin蛋白与MDR1 mRNA的表达之间呈显著正相关（χ2＝6.15，P＜0.05），survivin阳性表达率在MDR1 mRNA阳性组中较高,见表2，其表达与MRP mRNA表达间无相关性（P＞0.05）。
表2 113例NSCLC中survivin和MDR1mRNA表达之间的关系（略）
2．3．2 bcl?2与MRP mRNA表达之间存在明显正向关系（χ2＝4.64，P＜0.05），在bcl?2呈阳性表达的病例中，MRP mRNA也多数呈阳性表达, 见表3，其表达与MDR1 mRNA表达间无相关性（P＞0.05）。
表3 113例NSCLC中bcl?2和MRP mRNA表达之间的关系（略）
2．3．3 bax表达与多药耐药基因MDR1mRNA、MRPmRNA表达之间差异无统计学意义（P＞0.05）。
3 讨论
NSCLC原发性耐药是中的棘手问题，其产生涉及多种复杂过程。MDR1和MRP编码的膜糖蛋白介导的药物外排泵是传统的耐药机制。细胞凋亡抑制参与多药耐药形成是近年来研究的热点问题。许多抗肿瘤药物是细胞凋亡的诱导剂，其效应可能主要是触发了肿瘤细胞程序化死亡通路。凋亡有可能是大多数化疗药物作用的最终共同途径，肿瘤细胞的耐药可能是细胞凋亡的抑制。survivin是目前所知的凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族中最小的成员，也是迄今发现的最强的凋亡抑制因子之一。研究发现，survivin普遍表达于大多数肿瘤细胞，但在成人组织一般不表达或低表达。在有丝分裂中，survivin特异地结合caspase?3和caspase?7，直接抑制后两者的活性，阻断细胞的凋亡过程[1]。Olie等[2]用survivin的反义寡核苷酸导入肺腺癌A549细胞中，封闭survivin基因的表达，发现肺癌细胞对化疗药物诱导的细胞凋亡敏感性增加。Joseph等[3]报道，survivin能降低肺癌细胞对化疗的敏感性。在胰腺癌[4]、白血病[5]和卵巢癌[6]等恶性肿瘤中也证实survivin的高表达与肿瘤细胞的耐药有关。本组NSCLC中survivin的阳性率为79.6%，并与MDR1 mRNA的表达之间呈显著正相关，提示survivin高表达可能是NSCLC患者对初次化疗不敏感的原因之一。从分子水平分析，survivin基因位于染色体17q25，MDR1基因位于染色体7q21，两基因位点并不一致，推测在肿瘤细胞内，二者之间可能存在转录活化的协同诱导机制，促使这两个基因产物共同表达。
bcl?2和bax属于同一基因家族，在细胞凋亡通路上起正负调节作用，二者的比率被认为是调节凋亡易感性的重要因素。有研究发现bcl?2蛋白过表达参与NSCLC中MDR形成。可能由于肿瘤细胞中bcl?2蛋白表达量增加，导致凋亡阻断作用过强，因此抑制了药物诱导的细胞凋亡，同时也降低了细胞对化疗药物的敏感性[7]。本组NSCLC中bcl?2蛋白表达率为59.3%，且其表达与MRP mRNA表达呈正向关系，显示bcl?2可能是通过介导MRP mRNA的高表达，成为参与NSCLC原发耐药的重要因素之一，二者之间具体的调节机制仍有待于深入研究。bax通过抑制bcl?2而致细胞凋亡，其是否与肺癌耐药有关仍有不同看法。本研究中bax与MDR1 mRNA、MRP mRNA表达无关，推测bax可能不是影响NSCLC原发耐药的因素。本文结果还提示，MDR1mRNA和MRPmRNA在不同组织学类型、分化程度、TNM分期和淋巴结转移状态的NSCLC中的表达差异无显著性，但survivin和bax的表达与肿瘤分化程度有关，bcl?2与组织学类型有关，检测它们的表达，对判断肿瘤的及其转归有一定的价值。
NSCLC原发性多药耐药的形成机制是一个复杂的体系。本研究结果显示，凋亡抑制蛋白survivin的高表达和bcl?2的过表达可能是导致NSCLC原发耐药的重要因素，检测survivin和bcl?2的阳性率对临床逆转 NSCLC多药耐药性具有一定指导意义。
【】
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